ATP敏感性鉀通道開放劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、缺血性腦血管病是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病，臨床上一直把尋找確實(shí)有效的腦保護(hù)藥物作為研究的重點(diǎn)內(nèi)容。ATP敏感性鉀通道(KATP)開放劑是近年新興的一種腦保護(hù)劑，但其保護(hù)作用機(jī)制仍不清楚。腦缺血治療的關(guān)鍵是減輕腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞內(nèi)有一套精細(xì)復(fù)雜的信號(hào)系統(tǒng)在調(diào)控著凋亡過程。目前認(rèn)為死亡受體通路和線粒體通路是細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而死亡受體通路和線粒體通路分別以caspase-8和caspase-9的激活為特征，二者再進(jìn)

2、一步激活下游的caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)觀察了KATP通道開放劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評(píng)分、神經(jīng)元凋亡及caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討KATP通道開放劑對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為臨床應(yīng)用KATP通道開放劑治療缺血性腦血管病提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)的實(shí)際應(yīng)用意義。 實(shí)驗(yàn)方法：選擇Wistar雄性大鼠220

3、只隨機(jī)分為四組：A組(假手術(shù)組)、B組(缺血組)、C組(KATP通道開放劑治療組)及D組(KATP通道開放劑+阻斷劑治療組)。應(yīng)用改良Nagasawa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，應(yīng)用TTC染色觀察梗死體積，記錄神經(jīng)功能缺損評(píng)分；應(yīng)用TUNEL法觀察神經(jīng)元凋亡；應(yīng)用免疫組化、原位雜交、RT-PCR技術(shù)研究腦缺血再灌注后caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA及其蛋白的表達(dá)，探討KATP通道

4、開放劑對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.腦梗死體積A組未發(fā)現(xiàn)有梗死病灶，B、C、D組梗死病灶主要位于右側(cè)額頂葉皮質(zhì)及尾狀核、殼核區(qū)域。B、C、D組梗死體積與A組相比均有顯著性差異(P＜0.01)。C組梗死體積明顯小于B組和D組(P＜0.01)，D組與B組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

5、 2.神經(jīng)功能缺損評(píng)分B、C、D組神經(jīng)功能缺損評(píng)分與A組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。C組神經(jīng)功能缺損較B、D組明顯減輕(P＜0.05)，B、D組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3.神經(jīng)元凋亡結(jié)果A組僅見少量凋亡細(xì)胞，B、C、D組凋亡細(xì)胞主要分布于缺血周邊區(qū)，即缺血半暗帶內(nèi)。凋亡細(xì)胞于腦缺血再灌注后6h增多，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，于腦缺血再灌注后24h凋亡細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，缺血后48h、72h凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少。各組在缺

6、血中心區(qū)凋亡細(xì)胞表達(dá)均較少。B、C、D組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞與A組相比均有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，C組6h時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞與B、D組相比有下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)元顯著性差異(P＞0.05)，C組其余各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)較B、D組均顯著減少(P＜0.01，P＜0.05)。D組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)與B組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 4.免疫組化結(jié)果A組僅見少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，B、C、D組各時(shí)間點(diǎn)caspase-3、caspas

7、e-8、caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于缺血周邊區(qū)，即半暗帶內(nèi)，缺血中心區(qū)內(nèi)較少表達(dá)。B、C、D組caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達(dá)均于腦缺血再灌注后6h開始增加，以后隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，24h達(dá)高峰，以后表達(dá)下降。C組僅caspase-8蛋白在6h時(shí)間點(diǎn)與B、D組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)C組的caspase-3、caspase-8、及caspase-9蛋白表達(dá)均顯著少

8、于B組和D組(P＜0.01，P＜0.05)，D組各時(shí)間點(diǎn)caspase-3、caspase-8、及caspase-9蛋白表達(dá)與B組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 5.原位雜交結(jié)果A組僅見少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，B、C、D組caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA的陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于缺血周邊區(qū)內(nèi)，缺血中心區(qū)內(nèi)較少表達(dá)。缺血再灌注后6h陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)開始增加，24h達(dá)高峰，以后表達(dá)下降。C組僅caspase-9

9、mRNA陽(yáng)性細(xì)胞在6h時(shí)間點(diǎn)與B，D組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)caspase-3，caspase-8，caspase-9mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均顯著少于B組和D組(P＜0.01，P＜0.05)，D組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)與B組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 6.RT-PCR結(jié)果A組caspase-3、caspase-8、caspase-9mRNA僅見微弱表達(dá)，B、C、D組caspase-3、caspase-

10、8和caspase-9mRNA隨腦缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，于缺血再灌注后24h達(dá)高峰，以后表達(dá)逐漸減弱。C組各時(shí)間點(diǎn)caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA的表達(dá)均顯著少于B組和D組(P＜0.01)，D組各時(shí)間點(diǎn)caspase-3、caspase-8和caspase-9mRNA的表達(dá)與B組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1.KATP通道開放劑能顯著減少腦缺血再灌注后梗死體積，改善神經(jīng)