ATP敏感性鉀通道開放劑埃他卡林對谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、谷氨酸(glutamate，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與生理及病理過程的調(diào)節(jié)。適量的Glu對于維持細(xì)胞的正常生理活動是必需的，但胞外Glu濃度過高則會產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。自1957年首次發(fā)現(xiàn)Glu長時間作用能夠引起神經(jīng)元損傷到1969年提出其毒性學(xué)說，人們對Glu興奮性毒性的認(rèn)識逐漸加深。Glu興奮性毒性(excitotoxicity)是指胞外Glu釋放過多

2、或攝取被抑制，導(dǎo)致突觸間隙中Glu濃度急劇升高，過度激活N-methyl-D-aspartate(NMDA)受體，引起鈣離子的大量內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或凋亡。因此，抑制突觸前Glu的過度釋放或抑制突觸后Glu介導(dǎo)的興奮性毒性，是神經(jīng)保護(hù)的重要策略。 ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitivepotassiumchannels,KATP)是一類由胞內(nèi)ATP/ADP水平調(diào)控、非電壓依賴性的、直接耦聯(lián)細(xì)胞代

3、謝和電活動的特殊鉀離子通道，包括本實(shí)驗室在內(nèi)的研究已經(jīng)表明，KATP是包括PD在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)保護(hù)治療的新靶標(biāo)。埃他卡林(iptakalim，IPT)是以KATP為靶標(biāo)、由我國學(xué)者自行設(shè)計和合成的一個脂肪仲胺類小分子化合物，具有易透過血腦屏障的獨(dú)特優(yōu)勢。本實(shí)驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)IPT對多種神經(jīng)毒素導(dǎo)致的在體或離體細(xì)胞損傷均具有保護(hù)作用。 本文以PC12細(xì)胞為研究對象，首先鑒定了PC12細(xì)胞KATP亞基的組成，為IPT作

4、用靶點(diǎn)的確定奠定基礎(chǔ)；建立Glu興奮性毒性損傷模型，研究不同濃度IPT對Glu損傷的保護(hù)作用及其對高鉀誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Glu釋放的影響，探討IPT對Glu誘導(dǎo)的興奮性毒性的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，為IPT發(fā)展成為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的神經(jīng)保護(hù)治療新藥積累必要的實(shí)驗支持。 目的：鑒定PC12細(xì)胞上KATP亞基組成，探討IPT對Glu致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究。 方法：1)RT-PCR法在mRNA水平、Wester

5、nblotting和免疫熒光法在蛋白水平分別鑒定PC12細(xì)胞的KATP亞基組成；2)MTT法測定細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗分組如下：①對照組；②Glu處理組：1、5、10、15、20mM；③10mMGlu+10μMIPT；④10mMGlu+10μMpinacidil；⑤10mMGlu+10μMIPT+10μMglibenclamide；⑥10mMGlu+10μMpinacidil+10μMglibenclamide；3)熒光

6、探針法測定PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子(calcium，Ca2+)濃度；高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)和熒光法聯(lián)合檢測細(xì)胞外液中Glu的濃度。 結(jié)果：1)利用RT-PCR、免疫熒光和Westernblotting方法鑒定發(fā)現(xiàn)，PC12細(xì)胞表達(dá)KATP，其亞基組成為Kir6.1和SUR2；2)Glu能夠濃度依賴性(1、5、10、15和20mM)降低PC12細(xì)胞活力，Glu

7、在10mM能夠?qū)⒓?xì)胞活力降至73﹪，選擇該濃度作為造模濃度。10μMIPT能夠顯著抑制Glu所致的PCI2細(xì)胞活力降低和凋亡，該作用可被glibenclamide所逆轉(zhuǎn)；3)10μMIPT能夠顯著抑制10mMGlu誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度升高，該作用能夠被glibenclamide完全取消。IPT能夠濃度依賴性(0.01、0.1、1、10和100μM)的抑制高鉀(80mMKCl)所致PC12細(xì)胞釋放Glu的增多，且該作用能夠被gliben