丹參酮ⅡA對慢性間歇性低氧所致高血壓大鼠心肌ET-1及其受體的影響.pdf

1、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（Obstructive Sleep Apnea Syndrome, OSAS）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，其臨床主要特征為夜間打鼾并伴有呼吸暫停，從而導致患者睡眠結構出現(xiàn)紊亂、長期動脈血氧飽和度的波動，進而出現(xiàn)慢性間歇性低氧（ Chronic Intermittent Hypoxia，CIH），最終引起身體的多個系統(tǒng)產(chǎn)生綜合性損傷。OSAS患者一般采用藥物干預治療、口腔矯治器治療、呼吸機持續(xù)氣道正壓通氣（C

2、PAP）治療以及外科手術治療等，但到目前為止，在臨床上還缺乏一種有效的治療方法可以治愈該疾病。
　　丹參酮IIA（Tanshinone IIA, Tan IIA）是一種從丹參中分離的二萜醌類化合物。它是一種有效的脂溶性單體，具有縮小心肌梗死面積及抗動脈粥樣硬化的作用，從而降低心肌耗氧量。此外，Tan IIA對血小板的聚集和血液凝固有抑制作用，可擴大冠狀動脈、增加血流量，改善缺氧誘導的心肌代謝紊亂及心功能，從而改善心肌缺氧的耐受性。

3、另外，Tan IIA還具有抗炎抗氧化的作用。
　　另外，OSAS患者血壓升高與內(nèi)皮素-1（Endothelin-1, ET-1）水平升高密切相關。ET-1是由內(nèi)皮細胞上合成一種強力的血管收縮肽，需與ETA或ETB受體結合后才能發(fā)揮作用。近來動物實驗證實了Tan IIA對ET-1的合成有抑制作用，并在某種程度上表現(xiàn)出了ET-1受體拮抗劑的效果，從而改善血管內(nèi)皮功能障礙。此外，Tan IIA可以通過調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡的基因表達從而抑制左

4、心室肥厚的發(fā)生這對心臟有一定的保護作用。
　　雖然，目前關于Tan IIA在保護內(nèi)皮細胞功能和心功能方面研究眾多，但是在保護由 CIH引起的血管內(nèi)皮細胞損傷以及心功能損傷的分子機制至今尚未十分清楚，也并未發(fā)現(xiàn)有關Tan IIA對CIH介導的ET-1及其受體的表達的信號通路方面的研究報道。
　　本研究就是探討Tan IIA對CIH大鼠心肌ET-1及其受體的影響，進一步探討Tan IIA在治療OSAS患者過程中的作用機制。

5、>　　目的：本課題擬從研究與CIH相關ET-1及其受體拮抗劑的熱點問題著手，探討Tan IIA對CIH誘導的高血壓大鼠心功能的調(diào)節(jié)作用和心肌損傷的保護作用，以期明確Tan IIA調(diào)節(jié)CIH的相關性作用機制。
　　方法：雄性SD(Sprague~Dawley)大鼠（體重為180~220 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供），隨機分成3組：常氧組（n=16）：暴露于常氧環(huán)境中飼養(yǎng)；CIH組（n=16）：暴露于 CIH環(huán)境中飼養(yǎng)；CIH

6、+Tan IIA組（n=16）：暴露于CIH環(huán)境中同時腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉（20 mg/kg）進行干預。將CIH組和CIH+Tan IIA組大鼠暴露于慢性間歇性低氧倉內(nèi)，并將系統(tǒng)設定為每一次低氧及復氧的循環(huán)時間為3 min，前1.5 min充入N2使倉內(nèi)氧濃度降至9％，后1.5 min充入純O2使倉內(nèi)氧濃度恢復到21%。每天暴露8 h共3周。造模結束后，將大鼠隨機用于實驗的不同部分。
　　在造模前一天17時進行大鼠尾動脈無創(chuàng)

7、血壓測量，待造模以后對每組大鼠進行血壓測量，記錄每只大鼠尾動脈收縮壓。在造模結束斷水斷糧12 h后，利用目內(nèi)眥取血，用于血液各項指標的檢測。隨后給予烏拉坦（5 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離右頸總動脈，將提前準備好的靜脈套管針（內(nèi)徑0.8 mm）中充入用生理鹽水配制的0.3%的肝素，并且與壓力換能器和多道生理信號采集系統(tǒng)連接，小心地插入動脈內(nèi)，在此過程中將采集到的數(shù)據(jù)錄入計算機。然后緩慢沿頸動脈繼續(xù)插管入左心室，當采集系統(tǒng)顯示出左室波型

8、后即停止繼續(xù)推入，待波形穩(wěn)定20 min后記錄的心率HR（Heart rate）、左室收縮內(nèi)壓LVSP（Left Ventricular Systolic Pressure）、左心室舒張末壓LVEDP（Left Ventricular End Diastolic Pressure）、左心室最大收縮和舒張速率 LV±dp/dtmax（ Maximum ascending and descending rate of Left Ventri

9、cular Pressure）。記錄上述指標之后，對常氧組大鼠和CIH組大鼠（n=8）再次進行股靜脈穿刺給藥ET-1（0.03 nmol/kg），記錄LVSP的最大值；當LVSP值恢復到給藥前水平10 min后，對兩組給予丹參酮IIA（10 mg/kg）作用20 min后，再次給藥ET-1（0.03 nmol/kg），讀取LVSP的最大值，并計算出給藥前后ET-1誘導收縮的最大變化率，進而對左心室功能進行評價。此外，對大鼠進行解剖，稱量

10、左心室重量，計算得出左心室重量指數(shù) LVWI（Left Ventricular Weight Index）。同時，一部分用多聚甲醛固定，一部分放入~80°C冰箱凍存，備用。本研究中利用蘇木精~伊紅染色法（Hematoxylin~eosin Staining, HE染色）觀察心臟的損傷程度以及給予Tan IIA干預后心臟組織的變化，同時采用免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測 ET-1以及其受體的蛋白表達，另外，還觀察T

11、an IIA對 CIH引起的一氧化氮（Nitric Oxide, NO）釋放的調(diào)節(jié)以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS)蛋白表達的影響。
　　結果：
　　1丹參酮IIA對CIH大鼠尾動脈壓的影響
　　造模3周后，與常氧組比較，CIH組大鼠尾動脈壓（149±4 mmHg）明顯升高（P<0.05）；與CIH組比較，CIH+Tan IIA組大鼠尾動脈壓（119

12、±3 mmHg）明顯降低（P<0.05）。
　　2丹參酮IIA對CIH大鼠體重 BW及心臟重量指數(shù) HWI、左心室重量指數(shù) LVWI的影響
　　與常氧組比較，CIH組大鼠體重（313±10 g）明顯降低（P<0.05）；與CIH組比較，CIH+Tan IIA組大鼠體重（331±8 g）未見差異。常氧組、CIH組、CIH+Tan IIA組大鼠的 HWI（3.14±0.05,3.08±0.07,3.06±0.08 mg/g）和

13、LVWI（2.06±0.09,1.98±0.08,2.08±0.11 mg/g）未見差異。
　　3丹參酮IIA對 CIH大鼠血流動力學的影響
　　與常氧組相比，CIH組大鼠的 LVSP、±dp/dtmax均明顯升高（P<0.05）；與 CIH組比較，CIH+Tan IIA組大鼠 LVSP、±dp/dtmax均明顯降低（P<0.05）。
　　4 ET-1和丹參酮IIA對 CIH大鼠 LVSP的影響
　　采用股靜脈注

14、射給予ET-1后，常氧組和 CIH組大鼠 LVSP均顯著升高（P<0.05）；與常氧組比較，CIH組大鼠的LVSP變化率明顯增高（P<0.05）；經(jīng)丹參酮 IIA干預后再次注射 ET-1，兩組大鼠LVSP均顯著降低（P<0.05），與常氧組相比，CIH大鼠 LVSP變化率顯著增加（P<0.01）。
　　5丹參酮IIA對CIH大鼠心肌組織形態(tài)學改變的影響
　　通過HE染色可觀察到，常氧組心肌細胞排列整齊且紋理清晰，心肌細胞呈桿

15、狀排列，核染色質(zhì)分布均勻；CIH組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞核收縮變性，心肌細胞間有結締組織增生，成纖維細胞增多，可見充血現(xiàn)象。CIH+Tan IIA組心肌細胞排列較CIH組整齊，心肌細胞呈桿狀，核染色質(zhì)分布較CIH組均勻，著色淺，成纖維細胞減少。
　　6丹參酮IIA對CIH大鼠血漿ET-1、血清NO含量的影響
　　較常氧組相比，CIH組大鼠的血漿ET-1含量明顯升高，而血清中NO含量明顯降低（P＜0.05）；與CIH組比較

16、，CIH+Tan IIA組大鼠血漿ET-1含量明顯降低，血清中NO含量顯著升高（P＜0.05）。
　　7免疫組化觀察丹參酮 IIA對 CIH大鼠心肌 ET-1、ETA和 ETB受體的表達影響
　　較常氧組相比，CIH組的 ET-1表達明顯升高，ETA受體表達增加，而CIH+Tan IIA組的ET-1和ETA受體的表達明顯降低。與常氧組比較，CIH組中ETB受體明顯降低，而CIH+Tan IIA組的ETB受體高于CIH組。

17、r>　　8 Western blot檢測丹參酮IIA對CIH大鼠心肌eNOS蛋白表達和ET-1及其受體蛋白表達的影響
　　較常氧組相比，CIH組的 ET-1蛋白表達量明顯增加，ETA受體的蛋白表達量增加，而CIH+Tan IIA組的ET-1和ETA受體的蛋白表達量明顯減少。與常氧組比較， CIH組中 ETB受體明顯減少，而CIH+Tan IIA組的ETB受體卻高于CIH組。CIH組eNOS的蛋白表達量較常氧組減少，而CIH+Tan