內(nèi)皮素-1在慢性間歇性低氧所致高血壓大鼠中的作用.pdf

1、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)主要表現(xiàn)為睡眠時(shí)打鼾并伴有呼吸暫停和睡眠淺表，夜間反復(fù)發(fā)生低氧血癥和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂。OSAS病人引起的長期的動(dòng)脈血氧飽和度波動(dòng)，造成慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia.CIH)，對(duì)身體多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。國外資料顯示，成年人中OSAS的患病率高達(dá)5％-20％。大量研究數(shù)據(jù)表明OSAS是除年齡、性別、

2、酗酒、精神緊張以及心、腎疾病外的高血壓病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其導(dǎo)致高血壓的確切發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未闡明。
　　內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是一種具有收縮血管和促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖作用的活性多肽。OSAS患者睡眠時(shí)呼吸暫停后的用力吸氣可導(dǎo)致胸腔負(fù)壓升高，靜脈回流增多，管腔剪切力增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損。同時(shí)CIH也可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，ET-1合成增加而降解減少，引起ET-1水平升高。眾多研究顯示OSAS患

3、者血壓增高與ET-1水平升高相關(guān)。
　　OSAS患者伴有肌肉交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，血漿兒茶酚胺濃度增加。目前有證據(jù)表明，CIH引起的動(dòng)脈血壓升高至少部分是由于增加了化學(xué)反射的敏感性，進(jìn)而增加交感神經(jīng)活動(dòng)，盡管引起動(dòng)脈血壓升高的機(jī)制不十分清楚，作為主要感受動(dòng)脈血氧變化的化學(xué)感受器，頸動(dòng)脈體，被證明介導(dǎo)CIH引起的交感神經(jīng)活動(dòng)和動(dòng)脈血壓的增加。如果預(yù)先切除頸動(dòng)脈體或腎交感神經(jīng)則可防止CIH誘導(dǎo)的動(dòng)脈血壓升高。研究表明，間歇性低氧可通過改變

4、頸動(dòng)脈體內(nèi)的神經(jīng)調(diào)質(zhì)而增加外周化學(xué)感受器的敏感性。大量研究數(shù)據(jù)提示ET-1增加頸動(dòng)脈體化學(xué)敏感性，同時(shí)改變頸動(dòng)脈體內(nèi)ETA和ETB受體表達(dá)。
　　目前有關(guān)ET-1在血壓調(diào)節(jié)及在高血壓發(fā)病中的作用機(jī)制尚未完全闡明，本研究利用模擬OSAS的大鼠CIH模型在整體動(dòng)物和離體器官水平，采用電生理學(xué)和分子生物學(xué)等方法探討了：(1)ET-1受體拮抗劑對(duì)CIH所致高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)及心肌組織形態(tài)學(xué)的影響；(2)ET-1對(duì)CIH大鼠頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放

5、電的影響及其分子機(jī)制；(3)CIH對(duì)大鼠主動(dòng)脈ET-1受體表達(dá)及血管內(nèi)皮功能的影響。
　　第一部分 ET-1受體拮抗劑對(duì)慢性間歇性低氧所致高血壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)及心肌組織形態(tài)學(xué)的影響
　　目的：探討內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)慢性間歇性低氧所致高血壓大鼠的降壓作用。
　　方法：健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重190-210g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將80只大鼠隨機(jī)分為6組：常氧對(duì)照組(Normoxia

6、)和間歇性低氧組(CIH)各24只，間歇性低氧斗BQ123組(CIH+BQ123)、間歇性低氧+BQ788組(CIH+BQ788)、間歇性低氧+BQ123+BQ788組(CIH+BQ123+BQ788)和間歇性低氧+DMSO組(CIH+DMSO)各8只。喂養(yǎng)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。
　　參照文獻(xiàn)建立間歇性低氧動(dòng)物模型。間歇性低氧艙采用自動(dòng)氣壓調(diào)控，程序設(shè)計(jì)每一低氧復(fù)氧循環(huán)時(shí)間為2min，前1min充N2使氧濃度降至9％，后一分鐘充

7、O2使氧濃度恢復(fù)到21％。除對(duì)照組大鼠置放于正常的艙內(nèi)予以空氣供氣外，其余5組大鼠在每日8時(shí)至16時(shí)放入間歇性低氧艙中，共21天。
　　常氧對(duì)照組和CIH組各選8只和其他4組大鼠各8只，在第一日上艙前2小時(shí)尾靜脈注射給予不同處理因素。其中對(duì)照組、CIH組分別注射生理鹽水(5ml/kg)；CIH+BQ123組注射BQ123(將BQ123用生理鹽水按10μg/ml稀釋，每次給予50μg/kg)；CIH+BQ788組注射BQ788(將B

8、Q788先用DMSO初溶，再用生理鹽水按10μg/ml稀釋，每次給予50μg/kg，其中DMSO終濃度<0.05％)；CIH+BQ123+BQ788組(分別將BQ123和BQ788按上述方法稀釋為20μg/ml后混勻，每次給予50μg/kg)；CIH+DMSO組注射DMSO(與BQ788組DMSO注射濃度相同)。以后每隔2天按上述方法重復(fù)注射一次。
　　分別檢測(cè)下列指標(biāo)：(1)重量檢測(cè)：包括體重(body weight，BW)、心

9、臟重量指數(shù)(heart weight index，HWI)、左心室重量指數(shù)(left ventricular weight index，LVWI)；(2)血液生化指標(biāo)：血漿ET-1、NO含量測(cè)定；(3)大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，每隔2天測(cè)量一次；(4)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：頸動(dòng)脈收縮壓(systolic arterial pressure，SAP)、頸動(dòng)脈舒張壓(diastolic arterialpressure，DAP)及頸動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓(mea

10、n arterial pressure，MAP)，心率(heart rate，HR)、左室收縮內(nèi)壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)和左室最大收縮和舒張速率(maximum ascending and descending rate of ventricularpressure，±d

11、p/dtmax)。完成上述血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后，對(duì)照組及CIH組大鼠繼續(xù)股靜脈插管給以ET-1(0.03nmol/kg)，讀取LVSP最大值，待LVSP恢復(fù)至藥前水平10min后兩組分別給以內(nèi)皮素受體拮抗劑(endothelinreceptor antagonists，ETRA)BQ1230.3mg/kg，BQ7880.3mg/kg，BQ123+BQ788各0.3mg/kg，20min后再次給以ET-1(0.03nmol/kg)，記錄LVS

12、P最大值，計(jì)算給予ETRA前后內(nèi)皮素誘導(dǎo)收縮的LVSP變化率。
　　(5)組織學(xué)檢測(cè)：HE染色觀察心肌組織的病理學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1 ETRA對(duì)CIH大鼠體重及HWI、LVWI的影響
　　與常氧對(duì)照組比較，CIH組大鼠體重明顯降低(P<0.05)；與CIH組比較，各給藥組大鼠體重未見差異。各組大鼠間HWI和LVWI亦未見差異。
　　2 ETRA對(duì)CIH大鼠血漿ET-1、血清NO含量的影響
　　

13、與常氧對(duì)照組比較，CIH組大鼠血漿ET-1含量顯著升高，血清NO含量顯著降低(P<0.01)；與CIH組比較，各給藥組大鼠血漿ET-1含量未見差異，CIH+BQ788組大鼠血清NO含量顯著降低(P<0.01)。
　　3 ETRA對(duì)CIH大鼠尾動(dòng)脈壓的影響
　　與常氧對(duì)照組比較，CIH組大鼠在造模第15后尾動(dòng)脈壓明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與CIH組比較，CIH+BQ123組與CIH+BQ123+BQ788組大鼠在

14、造模第12天后尾動(dòng)脈壓均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，其余各組未見差異。
　　4 ETRA對(duì)CIH大鼠頸動(dòng)脈壓的影響
　　與常氧對(duì)照組比較，CIH組大鼠頸動(dòng)脈SAP、DAP和MAP均明顯升高(P<0.01)；與CIH組比較，CIH+BQ123組與CIH+BQ123+BQ788組大鼠SAP、DAP和MAP均明顯降低(P<0.01)，其余各組未見差異。
　　5 ETRA對(duì)CIH大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響
　　與對(duì)

15、照組比較，CIH組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著升高；與CIH組比較，CIH+BQ123組與CIH+BQ123+BQ788組大鼠LVSP、±dp/dtmax均明顯降低(P<0.01)，其余各組無顯著差異。
　　6 ET-1和ETRA對(duì)CIH大鼠LVSP的影響
　　完成上述血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后，常氧對(duì)照組和CIH組繼續(xù)股靜脈注射給藥觀察LVSP變化情況。股靜脈注射ET-1后常氧對(duì)照組和CIH組大鼠LVSP均顯著升高(P<0

16、.05)，其中CIH組大鼠LVSP變化率明顯高于常氧對(duì)照組(P<0.01)；經(jīng)BQ123單獨(dú)或聯(lián)合BQ788干預(yù)后再次注射ET-1，兩組大鼠LVSP均顯著降低(P<0.05)，與常氧對(duì)照組比較，CIH大鼠LVSP變化率明顯升高(P<0.01)；而經(jīng)BQ788干預(yù)后再次注射ET-1，常氧對(duì)照組大鼠LVSP顯著升高(P<0.05)，CIH組大鼠LVSP未見明顯變化，與常氧對(duì)照組比較，CIH組大鼠LVSP變化率明顯降低(P<0.01)。7 E

17、TRA對(duì)CIH大鼠左心室組織形態(tài)學(xué)的影響
　　CIH組與DMSO組大鼠心肌組織病變程度相似，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞萎縮，部分心肌細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，部分內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落。
　　CIH±BQ123組與CIH+BQ123+BQ788組大鼠主要表現(xiàn)為部分心肌細(xì)胞萎縮，少量內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落。與CIH組相比，病變程度明顯減輕。
　　CIH+BQ788組大鼠主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞明顯萎縮，片狀壞死伴纖維化，與CIH組相比明顯加重。
　　結(jié)

18、論：ETA受體拮抗劑BQ123以及ETA受體拮抗劑BQ123和ETB受體拮抗劑BQ788聯(lián)合應(yīng)用均可降低CIH所致高血壓，有效調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)CIH所致心肌損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　第二部分 ET-1對(duì)慢性間歇性低氧大鼠頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放電的影響及其分子機(jī)制
　　目的：觀察ETRA及相關(guān)信號(hào)通路拮抗劑對(duì)ET-1誘發(fā)CIH大鼠CSN放電增強(qiáng)的影響以探討ET-1作用于頸動(dòng)脈體的分子機(jī)制。
　　方法：清潔級(jí)雄性SD

19、大鼠，體重190-210g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，隨機(jī)分成2組：常氧對(duì)照組和CIH組。飼養(yǎng)方法及CIH造模方法同第一部分。分別檢測(cè)下列指標(biāo)：(1)采用隔離灌流技術(shù)，觀察給予不同處理因素后頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放電的變化情況。給予不同濃度ET-1(50，100，200，400 pmol/L)灌流，觀察頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放電的劑量反應(yīng)曲線；給予平穩(wěn)后，分別給予ETA受體拮抗劑BQ123(10μmol/L)，ETB受體拮抗劑BQ788(10μmol/L)

20、，選擇性L-型鈣離子通道拮抗劑硝苯地平(10μmol/L)，PLC拮抗劑U73122(10μmol/L)，PKC拮抗劑Chelerythine chloride(10μmol/L)，p38MAPK拮抗劑SB203580(10μmol/L)以及CaMKⅡ拮抗劑KN-62(10μmol/L)干預(yù)15分鐘后，再次給予ET-1(200 pmol/L)灌流，記錄頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放電最大值。(2)采用Western blotting技術(shù)，在間歇性低氧后

21、不同時(shí)間(15min，1h，3h，5h，8h，2w2h and3w)分別取常氧對(duì)照組及CIH組大鼠頸動(dòng)脈體測(cè)定ETA，ETB，p38 MAPK，phospho-p38 MAPK，phospho-CaMKⅡ和phosphor-PKC的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 CIH對(duì)CSN放電的影響
　　與常氧對(duì)照組比較，CIH組大鼠CSN放電明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　2 ET-1對(duì)CIH大鼠CSN放電的影響
　

22、　與常氧對(duì)照組比較，劑量反應(yīng)曲線顯示CIH組大鼠對(duì)不同劑量ET-1誘導(dǎo)CSN放電均明顯增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。
　　3 CIH對(duì)頸動(dòng)脈體ETA和ETB蛋白表達(dá)的影響
　　與常氧對(duì)照組比較，CIH后頸動(dòng)脈體ETA和ETB蛋白表達(dá)均明顯增多(P<0.01)。
　　4 ETRA對(duì)ET-1誘導(dǎo)CSN放電增強(qiáng)的影響
　　在兩組中，選擇性ETA受體拮抗劑BQ123均可阻斷ET-1誘發(fā)的CSN放電增強(qiáng)(P<0.01

23、)，然而選擇性ETB受體拮抗劑BQ788對(duì)ET-1誘發(fā)的CSN放電增強(qiáng)則無影響。
　　3 CIH不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠頸動(dòng)脈體p38MAPK，P-p38MAPK，PKC以及CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響
　　與常氧對(duì)照組比較，在CIH后3w頸動(dòng)脈體中p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增多，p-p38MAPK蛋白表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯增多，P-PKC蛋白表達(dá)在1h，3h，8h，2w2h，3w后增多，p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)在1h，8h，2w2h，3

24、w后增多(P<0.01或P<0.05)。
　　4部分信號(hào)通路拮抗劑對(duì)ET-1誘導(dǎo)CIH大鼠CSN放電的影響
　　應(yīng)用選擇性L-型鈣離子通道阻斷劑硝苯地平，PLC拮抗劑U73122，PKC拮抗劑Chelerythine chloride，p38MAPK拮抗劑SB203580以及無鈣灌流液均能降低ET-1誘導(dǎo)的CSN放電增強(qiáng)，CIH組大鼠較常氧對(duì)照組大鼠更為顯著(P<0.01)；選擇性CaMKⅡ拮抗劑KN-62能增加ET-1誘導(dǎo)

25、的CSNA增強(qiáng)(P<0.01)。
　　結(jié)論：CIH可誘發(fā)大鼠CSN放電增強(qiáng)，可能與CIH使頸動(dòng)脈體ETA受體上調(diào)，對(duì)ET-1的敏感性加強(qiáng)有關(guān)；ET-1使CIH大鼠頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放電增強(qiáng)可能與激活PLC/PKC/p38MAPK.信號(hào)通路、L-型鈣離子通道及CaMKⅡ有關(guān)。
　　第三部分慢性間歇性低氧對(duì)大鼠主動(dòng)脈ET-1受體表達(dá)及血管內(nèi)皮功能的影響
　　目的：探討CIH對(duì)大鼠主動(dòng)脈ET-1受體表達(dá)及血管內(nèi)皮功能的影響。

26、>　　方法：清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重190-210g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，隨機(jī)分成2組：常氧對(duì)照組和CIH組。飼養(yǎng)方法及CIH造模方法同第一部分。造模結(jié)束后分別取各組大鼠主動(dòng)脈進(jìn)行檢測(cè)。(1)采用離體血管灌流技術(shù)，觀察乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)對(duì)苯腎上腺素(phenylephrine，PE)預(yù)收縮產(chǎn)生的舒張效應(yīng)的影響；觀察外源性ET-1對(duì)各組主動(dòng)脈環(huán)張力的影響，以及選擇性ETA受體阻斷劑BQ123，選擇性ETB

27、受體阻斷劑BQ788和NOS抑制劑L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)主動(dòng)脈環(huán)張力的影響。(2)HE染色觀察主動(dòng)脈的組織病理學(xué)變化。(3)RT-PCR測(cè)定ET-1，ETA和ETB受體mRNA的表達(dá)。(4)免疫組織化學(xué)法觀察ET-1、ETA受體和ETB受體的表達(dá)分布。(5)Western Blotting測(cè)定eNOS蛋白的表達(dá)。(6)酶轉(zhuǎn)化法測(cè)定主動(dòng)脈組織中NO的含量。
　　結(jié)果：
　　1 CIH對(duì)ET-1誘導(dǎo)主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響

28、　　大鼠主動(dòng)脈對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮呈劑量依賴性增強(qiáng)，與常氧內(nèi)皮完整主動(dòng)脈環(huán)相比，常氧去除內(nèi)皮和CIH均能使主動(dòng)脈對(duì)ET-1的敏感性增強(qiáng)(P<0.01)，但與CIH大鼠相比，常氧去內(nèi)皮組主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)更為敏感(P<0.01)。
　　2 CIH對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響
　　在CIH組ACh對(duì)PE預(yù)收縮產(chǎn)生的舒張效應(yīng)明顯低于常氧內(nèi)皮完整組(P<0.01)，明顯高于常氧去內(nèi)皮組(P<0.01)。
　　

29、3 ET-1受體阻斷劑對(duì)ET-1誘導(dǎo)主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響
　　對(duì)于不同組的大鼠主動(dòng)脈環(huán)，BQ123幾乎均能完全阻斷ET-1誘導(dǎo)的主動(dòng)脈收縮。BQ788部分抑制ET-1誘導(dǎo)的收縮，在CIH組，BQ788對(duì)ET-1誘導(dǎo)收縮的抑制作用明顯高于常氧內(nèi)皮完整組(P<0.01)，但顯著低于去內(nèi)皮組(P<0.01)。
　　4 NOS抑制劑L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響
　　在常氧內(nèi)皮完整的情況下，L-NAME可顯著加強(qiáng)E

30、T-1誘導(dǎo)的收縮(P<0.01)，常氧去除內(nèi)皮和間歇性低氧后，L-NAME對(duì)ET-1誘導(dǎo)的收縮均無影響，內(nèi)皮完整組比較有顯著性差異(P<0.01)。
　　5 CIH對(duì)主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的影響
　　HE染色觀察常氧大鼠主動(dòng)脈，內(nèi)皮層完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列規(guī)則；經(jīng)過CIH處理后的大鼠主動(dòng)脈，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿萎縮，局部細(xì)胞脫落。
　　6 CIH對(duì)大鼠主動(dòng)脈ET-1、ETA受體和ETB受體mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響
　　與常氧大鼠相比

31、，CIH大鼠主動(dòng)脈ET-1和ETA受體mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，ETB受體mRNA表達(dá)卻明顯降低(P<0.01)。免疫組織化學(xué)分析其蛋白定位發(fā)現(xiàn)，CIH處理后，大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層和平滑肌層均有ET-1表達(dá)的增多，ETA受體主要集中在平滑肌層表達(dá)，并且CIH使血管平滑肌層ETA受體表達(dá)增多，ETB受體在平滑肌層和內(nèi)皮層均有分布，并且CIH后，ETB受體在平滑肌和內(nèi)皮層的表達(dá)均有減少。
　　7 CIH對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織NO含量