循環(huán)性間歇性低氧對大鼠頸動脈體內NO抑制作用的研究.pdf

1、在阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）病人中，患有全身性高血壓的比例很高。但OSA引起動脈壓升高的機制仍未完全明確。有研究顯示，OSA病人的交感神經活動增強，并且對OSA病人進行有效的鼻部持續(xù)性氣道正壓通氣治療(continuous positive airway pressure，CPAP)可以降低其交感神經活動和動脈壓。此外，有研究發(fā)現循環(huán)性間歇性低氧(cyclic intermittent

2、hypoxia，CIH)誘發(fā)嚙齒類動物的動脈壓升高，而且動脈壓的升高需要持續(xù)的交感神經興奮，因為CIH暴露前預先切斷腎神經抑制動脈壓的升高。這些結果說明持續(xù)的交感神經興奮是OSA病人全身動脈壓升高的關鍵因素。交感神經活動可以被外周反射活動和中樞交感處理過程影響。大量的研究顯示:CIH暴露動物和OSA病人的外周化學反射敏感性增強，而化學敏感性增強有助于交感神經興奮和高血壓的發(fā)展。這些數據顯示OSA造成的CIH增強病人的外周化學敏感性，但對

3、CIH增強頸動脈體化學敏感性的機制的研究很少。
　　大量的研究指出一氧化氮(nitric oxide，NO)是CIH增強頸動脈體化學敏感性的一種調質。生理濃度的NO對化學敏感性反應主要起抑制作用。NO主要由直接支配頸動脈體且胞體位于竇神經或舌咽神經內的神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)免疫陽性神經元合成并釋放。有研究顯示，慢性心衰家兔頸動脈體的nNOS表達減少，并且這種減少

4、有助于增強化學敏感性。最近，有證據表明CIH降低大鼠頸動脈體nNOS的表達，但nNOS表達減少是否增強化學敏感性仍不清楚。本研究旨在觀察CIH對大鼠頸動脈體及頸動脈體球細胞nNOS表達的影響和CIH對頸動脈體內NO抑制作用的影響，進而探討CIH增強大鼠外周化學敏感性的機制。
　　目的:利用CIH大鼠模型和CIH頸動脈體球細胞，觀察CIH對大鼠頸動脈體及頸動脈體球細胞nNOS表達的影響和CIH對頸動脈體內NO抑制作用的影響。

5、　　方法:1.雄性Sprague-Dawley大鼠，體重240-250g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，在空氣濕度45％～55％，室溫20℃～22℃的環(huán)境下飼養(yǎng)一周后，隨機分成3組:空白對照組、常氧對照組和CIH組。將CIH組大鼠放置于間歇性低氧艙內，予以每天8h共35天的低氧暴露，程序設計為每一低氧復氧循環(huán)時間為4min，前1min充入100％ N2使氧濃度降至8.2％～10％,后3min充入O2使氧濃度恢復到21％。常氧對照組大鼠放

6、置于同樣的低氧艙內，但是向艙內沖入空氣而不是氮氣和氧氣?？瞻讓φ战M放置于標準室內條件下飼養(yǎng)。喂養(yǎng)期間動物自由進食、飲水。35天后取各組大鼠進行檢測:(1)大鼠股動脈插入導管，檢測大鼠的股動脈壓，觀察CIH對大鼠動脈壓的作用。(2)記錄常氧條件下，基礎的竇神經放電，觀察CIH對大鼠基礎竇神經放電的影響。(3)記錄10％低氧條件下，常氧對照組和CIH組大鼠的低氧敏感性竇神經放電，觀察CIH對頸動脈體化學敏感性的影響。(4)采用隔離灌流技術，

7、向大鼠頸動脈體內分灌注nNOS抑制劑L-omega-nitro arginine（L-NNA0.3mg/kg）、NO供體S-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP30 nmol/kg)和NO前體L-精氨酸(L-arginine100mg/kg)，在10％低氧條件下記錄常氧對照組和CIH組大鼠的竇神經放電，觀察CIH對NO抑制作用的影響。(5)采用Western blot和RT-PCR技術，觀察CIH對大鼠頸

8、動脈體nNOS蛋白及nNOS mRNA表達的影響。2.將出生19-21天的SD大鼠的頸動脈體取出，用酶消化的方法得到頸動脈體球細胞，然后將細胞分別在常氧和CIH環(huán)境下培養(yǎng)，CIH程序設計為每一低氧復氧循環(huán)時間為60分鐘，前35分鐘向低氧培養(yǎng)室內沖入100％N2使氧濃度降至0.1％，后25min充入O2使氧濃度恢復到21％。培養(yǎng)期間CO2濃度一直維持在5％。培養(yǎng)箱溫度維持在37℃。然后分別取對照組和CIH組培養(yǎng)6h、12h、24h和48h

9、的球細胞進行免疫細胞化學檢測，在顯微鏡下觀察CIH對單個球細胞nNOS蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1 CIH對大鼠動脈壓的影響
　　與常氧對照組和空白對照組比較，CIH組大鼠股動脈壓明顯升高(n=6;常氧對照組91.5±2.8 mmHg;空白對照組90.0±1.0 mmHg; CIH組115.8±2.9 mmHg;P＜0.01)。
　　2 CIH對大鼠基礎竇神經放電的影響
　　與常氧對照組和空白對照組

10、比較，CIH組大鼠的基礎竇神經放電明顯增強（n=6;常氧對照組24.2±1.1 mV/s;空白對照組22.2±0.89 mV/s;CIH組35.9±2.2 mV/s;P＜0.01）。
　　3 CIH對大鼠竇神經低氧敏感性放電的影響
　　在10％低氧條件下，CIH組的竇神經放電與其基礎放電的百分比明顯大于常氧對照組(CIH組623.1±13.5％of baseline;常氧對照組485.6±18.0％of baseline;

11、P＜0.01)。
　　4 nNOS抑制劑L-NNA對大鼠竇神經低氧敏感性放電的影響
　　頸動脈內注入nNOS抑制劑L-NNA明顯的增加了兩組大鼠10％低氧條件下的竇神經放電（CIH組699.1±15.6％ of baseline，P＜0.05;常氧對照組786.4±50.4％ of baseline，P＜0.01），但是對常氧對照組的影響明顯大于CIH組（P＜0.01）。
　　5 NO供體SNAP和NO前體L-argi

12、nine對大鼠竇神經低氧敏感性放電的影響
　　頸動脈內注入NO供體SNAP（CIH組264.0±10.8％ of baseline;常氧對照組340.0±9.2％of baseline）和NO前體L-arginine（CIH組390.2±15.6％ of baseline;空白對照組238.2±7.7％ of baseline）明顯的降低了兩組大鼠10％低氧條件下的竇神經放電，但是對CIH組的影響明顯大于常氧對照組(P＜0.01)

13、。
　　6 CIH對頸動脈體nNOS蛋白及其mRNA表達的影響
　　與常氧對照組比較，CIH組大鼠頸動脈體內的nNOS蛋白及nNOSmRNA表達均明顯減少(P＜0.005)。
　　7 CIH對頸動脈體球細胞nNOS蛋白表達的影響
　　免疫細胞化學結果顯示，與對照組比較，CIH組細胞的nNOS蛋白表達減少。
　　結論:1.CIH通過降低大鼠頸動脈體內nNOSmRNA及蛋白的表達，增強頸動脈體的化學敏感性。2.