興凱湖翹嘴鲌肌肉品質(zhì)及相關(guān)候選基因研究.pdf

1、興凱湖翹嘴鲌（Culter alburnus in Xingkai Lake）又名興凱湖大白魚，其肉色亮白如玉，肉質(zhì)細嫩鮮美，是我國四大淡水名魚之一，具有很高的經(jīng)濟價值。近年來，由于過度捕撈及產(chǎn)卵場環(huán)境惡化，野生興凱湖大白魚已日漸瀕危，人工養(yǎng)殖應(yīng)運而生。但在人工養(yǎng)殖條件下，由于片面追求高生長速度、高產(chǎn)量，養(yǎng)殖群體的肉質(zhì)風味急劇下降，失去了野生大白魚的鮮嫩口感，導致其價格遠低于野生群體，嚴重影響了經(jīng)濟效益。
　　 本研究針對這一問

2、題，以興凱湖翹嘴鲌為試驗對象，采用常規(guī)分析方法測定并比較不同年齡興凱湖翹嘴鲌野生與養(yǎng)殖群體肌肉物理指標（pH值、肉色和質(zhì)構(gòu)特性）、常規(guī)營養(yǎng)指標、氨基酸含量、脂肪酸含量、部分血液生化指標和組織學特征，對其肌肉品質(zhì)進行初步評定。采用生物化學和分子生物學的方法，利用RACE和RT-PCR等技術(shù)，克隆與肉質(zhì)相關(guān)的重鏈肌球蛋白基因(MYHs)、生肌分化因子(MyoD)、肥胖基因產(chǎn)物(Leptin)和鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)，并對基因的結(jié)構(gòu)和功

3、能進行解析;采用Real Time PCR技術(shù)，從mRNA水平研究上述基因在不同年齡野生與養(yǎng)殖群體表達差異，探索基因表達與肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系，從分子水平對肌肉品質(zhì)差異的形成進行初步分析。試驗結(jié)果如下:
　　 1.從2齡后野生興凱湖翹嘴鲌肌肉pH值均顯著高于養(yǎng)殖群體，L*和b*值均顯著高于養(yǎng)殖群體，a*值顯著低于養(yǎng)殖群體（P＜0.05），肉色更加潔白，晶瑩剔透。興凱湖翹嘴鲌野生群體硬度、彈性、回復性等方面高于養(yǎng)殖群體（P＜0.05

4、），肌肉口感更好。興凱湖翹嘴鲌野生和養(yǎng)殖群體的肌纖維基本結(jié)構(gòu)相同，均為不規(guī)則多邊形，但野生群體比養(yǎng)殖群體的肌纖維直徑更小，肌纖維密度更大（P＜0.05）。這說明在肌肉物理特性和組織學特征方面，野生興凱湖翹嘴鲌肉質(zhì)表現(xiàn)更為優(yōu)異。
　　 2.2齡野生和養(yǎng)殖群體興凱湖翹嘴鲌肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分含量無顯著差異(P＞0.05);4齡、6齡野生翹嘴鲌肌肉水分和粗蛋白含量顯著高于養(yǎng)殖群體(P＜0.05)，脂肪含量明顯低于養(yǎng)殖群體（P＜0.05）。

5、野生興凱湖翹嘴鲌鈣和磷含量比一般常見養(yǎng)殖魚類高。野生和養(yǎng)殖興凱湖翹嘴鲌的氨基酸組成一致，甘氨酸(Gly)含量最高，谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)次之。野生興凱湖翹嘴鲌氨基酸總量、必需氨基酸總量和鮮味氨基酸含量明顯高于養(yǎng)殖群體(P＜0.05)。說明野生興凱湖翹嘴鲌食用價值和肉味鮮美程度明顯優(yōu)于養(yǎng)殖群體，且隨年齡增長愈加明顯。
　　 3.野生興凱湖翹嘴鲌與養(yǎng)殖群體脂肪酸組成一致，以油酸(C18(∶)1)、亞油酸(C18(∶)2n

6、-6)和棕櫚酸(C16(∶)0)為主。但其多不飽和脂肪酸(PUFA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)總量顯著高于養(yǎng)殖群體（P＜0.05）。這也是興凱湖翹嘴鲌野生群體肉質(zhì)風味和營養(yǎng)保健功能優(yōu)于養(yǎng)殖群體的重要原因之一。興凱湖翹嘴鲌野生群體血清中的膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(Glu)、總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量明顯低于養(yǎng)殖群體，高密度脂蛋白(HDLC)含量高于養(yǎng)殖群體，說明野生興凱湖翹嘴鲌的能量代謝正常

7、，血脂水平較低，體現(xiàn)了血脂和體脂的正相關(guān)，從而表現(xiàn)出更優(yōu)良的健康水平。
　　 4.克隆分離出興凱湖翹嘴鲌MYHs兩個亞型(MYHa和MYHb)，其中MYHa cDNA全長6003bp，開放閱讀框(ORF)長5802bp，編碼1933個氨基酸;MYHb cDNA全長為5990bp，開放閱讀框為5793bp，編碼1930個氨基酸。將其提交到Genbank上，其登錄號分別為JX272926和JX402919。通過比對，這兩個基因同源性

8、低(73％)，且3'非翻譯區(qū)有很大的差異，因此，這是一個基因的兩個同型異構(gòu)體，既是結(jié)構(gòu)蛋白又是功能蛋白。MYHa和MYHb分別與鰱（Hypophthalmichthys molitrix）快速骨骼肌MYH type1型和MYH type3型同源性最高，分別為98％和97％，與其他魚類同源性達到90％以上，說明興凱湖翹嘴鲌MYHs具有較高的保守性。
　　 5.克隆分離興凱湖翹嘴鲌MyoD基因，其cDNA全長1096bp，開放閱讀框

9、為828bp，編碼275個氨基酸，將其提交到Genbank上，其登錄號分別為KC782835。通過對其結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸具有該家族的典型結(jié)構(gòu)域堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)，其中1～84個氨基酸為堿性區(qū)域，第98～141個氨基酸為螺旋環(huán)螺旋(HLH)結(jié)構(gòu)。興凱湖翹嘴鲌MyoD與草魚同源性最高，達99.3％，與哺乳動物相比也有大于60％的同源性，說明興凱湖翹嘴鲌MyoD相當保守。
　　 6.克隆分離興凱湖翹嘴鲌肥胖基因產(chǎn)物Le

10、ptin，其cDNA全長1208 bp，開放閱讀框522bp，編碼173個氨基酸，將其提交到Genbank上，其登錄號為KC782834。分析表明翹嘴鲌LeptinN端第20～21位為酶切位點，形成信號肽。
　　 7.克隆分離出興凱湖翹嘴鲌CAST部分序列共1997bp。通過NCBI Blast在線分析軟件比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與已公布的斑馬魚和草魚CAST相似性分別為90％和83％，說明CAST基因相對保守。
　　 8.

11、對不同時期野生與養(yǎng)殖群體興凱湖翹嘴鲌肌肉組織MYHs、MyoD、Leptin和CAST基因的表達研究表明，從2齡到6齡，野生群體MYHa表達量明顯低于養(yǎng)殖群體（P＜0.05），MYHb明顯高于養(yǎng)殖群體，魚體越大差異越明顯，兩種基因型共同作用影響肉質(zhì)性狀。從2齡后MyoD基因表達呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢，Leptin基因表現(xiàn)出下調(diào)性表達，而CAST基因下調(diào)趨勢從4齡開始明顯。因此，MYHs和MyoD是控制肌肉發(fā)育的主效基因，Leptin基因與機體脂