FGF-2調(diào)控C3H10細胞增殖及成軟骨分化的實驗研究.pdf

1、目的:構(gòu)建成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF-2)的真核表達質(zhì)粒，檢測其對小鼠間充質(zhì)干細胞C3H10增殖、成骨及成軟骨分化作用的影響。
　　方法:以質(zhì)粒pAd-Trace-FGF-2為模板，PCR擴增目的基因FGF-2，經(jīng)BglⅡ、SalⅠ雙酶切后連接至pIRES2-EGFP表達載體中獲得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表達質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到C3H10細胞中，另設(shè)pIRES2-

2、EGFP空載體轉(zhuǎn)染組和空白細胞對照組。RT-PCR及Westernblot法檢測各處理組FGF-2的表達水平，MTT法和流式細胞計數(shù)檢測細胞的增殖活力及細胞周期分布，RT-PCR檢測骨和軟骨相關(guān)標準蛋白、Wnt信號通路相關(guān)基因的mRNA水平表達變化，Western blot檢測Ⅱ型膠原(collagenⅡ，ColⅡ)的表達，甲苯胺藍染色檢測軟骨基質(zhì)的分泌情況。
　　結(jié)果:重組表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FGF-2經(jīng)雙酶切及測序

3、證實FGF-2正確插入相應多克隆區(qū)域;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C3H10細胞后，F(xiàn)GF-2基因的mRNA和蛋白水平表達較兩個對照組明顯增高，細胞增殖活力明顯增高(P＜0.05)，軟骨相關(guān)標志物Ⅰ型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)、ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)的mRNA水平較兩個對照組均顯著增高(P＜0.05)，骨鈣蛋白(osteocalcin，OC)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、骨橋蛋白（osteopon

4、tin，OPN）等成骨相關(guān)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無明顯升高(P＞0.05)，Wnt信號通路相關(guān)分子Wnt5a及Fzd8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低(P＜0.05)，F(xiàn)GF-2轉(zhuǎn)染組細胞甲苯胺藍染色呈現(xiàn)紫紅色異染。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建FGF-2基因重組真核表達質(zhì)粒，F(xiàn)GF-2過表達可提高C3H10細胞的增殖活力，對C3H10細胞有成軟骨效應，但短期成骨效應不明顯，F(xiàn)GF-2對C3H10的生物學效應可能與下調(diào)Wnt5a及受體Fzd8的表達有