FGF-2調(diào)控C3H10細(xì)胞增殖及成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor2，F(xiàn)GF-2)的真核表達(dá)質(zhì)粒，檢測(cè)其對(duì)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10增殖、成骨及成軟骨分化作用的影響。
　　方法:以質(zhì)粒pAd-Trace-FGF-2為模板，PCR擴(kuò)增目的基因FGF-2，經(jīng)BglⅡ、SalⅠ雙酶切后連接至pIRES2-EGFP表達(dá)載體中獲得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到C3H10細(xì)胞中，另設(shè)pIRES2-

2、EGFP空載體轉(zhuǎn)染組和空白細(xì)胞對(duì)照組。RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)各處理組FGF-2的表達(dá)水平，MTT法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力及細(xì)胞周期分布，RT-PCR檢測(cè)骨和軟骨相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)蛋白、Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA水平表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)Ⅱ型膠原(collagenⅡ，ColⅡ)的表達(dá)，甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)軟骨基質(zhì)的分泌情況。
　　結(jié)果:重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FGF-2經(jīng)雙酶切及測(cè)序

3、證實(shí)FGF-2正確插入相應(yīng)多克隆區(qū)域;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C3H10細(xì)胞后，F(xiàn)GF-2基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)較兩個(gè)對(duì)照組明顯增高，細(xì)胞增殖活力明顯增高(P＜0.05)，軟骨相關(guān)標(biāo)志物Ⅰ型膠原(collagenⅠ，ColⅠ)、ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)的mRNA水平較兩個(gè)對(duì)照組均顯著增高(P＜0.05)，骨鈣蛋白(osteocalcin，OC)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、骨橋蛋白（osteopon

4、tin，OPN）等成骨相關(guān)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯升高(P＞0.05)，Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子Wnt5a及Fzd8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低(P＜0.05)，F(xiàn)GF-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色呈現(xiàn)紫紅色異染。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建FGF-2基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒，F(xiàn)GF-2過(guò)表達(dá)可提高C3H10細(xì)胞的增殖活力，對(duì)C3H10細(xì)胞有成軟骨效應(yīng)，但短期成骨效應(yīng)不明顯，F(xiàn)GF-2對(duì)C3H10的生物學(xué)效應(yīng)可能與下調(diào)Wnt5a及受體Fzd8的表達(dá)有