基于ITS區(qū)多態(tài)性的柴胡類生藥鑒定用DNA芯片的研究.pdf

1、常用中藥柴胡(Radix Bupleuri)已有2000多年的應(yīng)用歷史,其來源為傘形科柴胡屬植物柴胡(北柴胡,Bupleurum chinense)和狹葉柴胡(南柴胡,B.scorzonerifolium)的干燥根,對治療流感、發(fā)燒、肝炎、瘧疾和月經(jīng)不調(diào)有明顯療效。全世界已報(bào)道的柴胡屬植物約有150種,我國分布42種、17變種、7變型。據(jù)調(diào)查,其中有36種(變種、變型)在不同地區(qū)和市場作為柴胡使用,包括有毒的大葉柴胡和含活性成分很低的小

2、柴胡等；有的地區(qū),甚至把當(dāng)?shù)厮a(chǎn)5、6種柴胡混在一起使用,造成市場混亂,藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定。這就迫切要求對柴胡進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定,以確保其質(zhì)量與安全。
　　 目前,柴胡的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征或其中的化學(xué)成分柴胡皂苷a、d的檢查,然而,由于同屬植物來源的生藥形態(tài)和顯微特征極近似,以及化學(xué)成分在植物發(fā)育和收獲后加工過程中可能會(huì)有很大的變化,使得用傳統(tǒng)方法對柴胡進(jìn)行鑒定存在相當(dāng)?shù)碾y度,因此,有必要建立更客觀、準(zhǔn)確、實(shí)用而簡便的方法。

3、>　　 核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed spacer)區(qū)具有較多的堿基信息,在長度上具有較好的保守性,特別適合于植物屬、組級的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究；通過對ITS區(qū)的測序及序列間的相互比較,可以對柴胡品種進(jìn)行區(qū)分,確定其來源。
　　 此外,過去幾年中,基因芯片已被證明是一種可行的生藥鑒定技術(shù)。由于國內(nèi)幾乎所有的基層結(jié)構(gòu)都沒有測序儀,有時(shí)測序費(fèi)用也會(huì)顯得比較昂貴,因此,在ITS序列多態(tài)性研

4、究的基礎(chǔ)上,針對不同植物來源的柴胡類生藥,可制備用于其鑒別的寡核苷酸基因芯片。
　　 目的：鑒于ITS序列及基因芯片在生藥鑒定中的可行性,本論文擬收集分布廣泛,品種較多的柴胡類生藥標(biāo)本,對其展開ITS序列及基因芯片的研究,尋找柴胡類生藥更準(zhǔn)確、簡便的鑒定方法。
　　 內(nèi)容：
　　 1.野外采集柴胡標(biāo)本,對柴胡在國內(nèi)的資源分布進(jìn)行考察。
　　 2.對收集的柴胡類生藥樣本提取總DNA,完成ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增測

5、序、數(shù)據(jù)分析,對ITS序列鑒定柴胡品種的可行性進(jìn)行評價(jià)。
　　 3.在ITS序列多態(tài)性研究的基礎(chǔ)上,針對6種不同植物來源的柴胡類生藥,制備用于其鑒別的寡核苷酸基因芯片,探討基因芯片運(yùn)用于柴胡類生藥鑒定的方法和前景。
　　 方法：
　　 1.標(biāo)本采集本研究中需要大量來源清晰、經(jīng)正確鑒定的柴胡類植物標(biāo)本與生藥樣品,獲得的主要途徑包括:
　　 1)野外采集；
　　 2)前期工作中采集和收集的標(biāo)本與樣品,

6、特別是利用國內(nèi)各標(biāo)本館中所藏柴胡屬植物標(biāo)本,如收藏柴胡屬植物標(biāo)本較多的復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館、華南植物所標(biāo)本館等；
　　 2.DNA提取及ITS擴(kuò)增
　　 1)采用植物基因組提取試劑盒對18種柴胡屬植物提取總DNA,用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測模板質(zhì)量；
　　 2)對所提取的DNA的ITS序列擴(kuò)增,引物采用5P、4P雙引物進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列分別為:
　　 “ITS5P”-5'>GGAAGGAGA AGTCG

7、TAACAAGG<3',“ITS4P”-5'>TCCTCCGCTTATTGATATGC<3'。
　　 反應(yīng)體系25μl:10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl,dNTP(各2.5 mmol/L)1μl,Taq酶1 U,引物(20μmol/L)各1μl,基因組DNA50-75 ng,加去離子水至25μl。
　　 反應(yīng)程序:93℃5 min,55℃2 min；93℃30 s,55℃45 s,70℃45 s,循環(huán)35次；70℃5mi

8、n。
　　 3.PCR產(chǎn)物回收、純化及測序PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen)回收,1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測后,由上海英俊工程有限公司測序部測序,各樣品均采用正向及反向雙向測序。
　　 4.序列比對及分析以柴胡屬近緣植物傘形科阿米芹族葛縷子亞族毒芹屬植物毒芹Cicuta virosaL.為外類群,與柴胡ITS序列進(jìn)行分析。DNA序列的排序用Clustal X軟件完成。ITS1、5.8S和ITS2的邊界參照G

9、enBank中發(fā)表的柴胡屬植物的ITS序列進(jìn)行劃分。排序后的序列使用MEGA4.0分子進(jìn)化遺傳分析軟件,采用K-2p參數(shù)遺傳距離(kimura-2parameter genetic distance),鄰接法(neighbor joining method)構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹；系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法(bootstraptest)檢驗(yàn),共進(jìn)行1000次循環(huán)。
　　 5.DNA芯片探針設(shè)計(jì)考察不同柴胡ITS序列之間的差異,確定

10、了各個(gè)種特異的多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)這些多態(tài)性位點(diǎn),為每種柴胡設(shè)計(jì)一條或多條引物用于其鑒定。
　　 6.DNA芯片制備制備的各探針及陽性對照、空白對照溶液各取10μL,加樣于384孔微孔板上,用裝配MicroQuill2000針頭的OmniGrid100微陣列點(diǎn)樣器打印于玻璃基板上。打印完畢的芯片在微陣列點(diǎn)樣器中放置30min,然后于室溫干燥30min。用B1清洗液沖洗5min后,雙蒸水沖淋,并于室溫下干燥。
　　 7.標(biāo)記<

11、br>　　 200μLPCR反應(yīng)管中進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記反應(yīng)引物如下:
　　 “ITSlA”-5’>GGATATCCGTTGCCGAGAGT<3’,“ITS5P”-5’>GGAAGGAGAAGTCGTACAAGG<3’。
　　 標(biāo)記反應(yīng)體系40μL:d(AGT)TP250μmol·L-1,dCTP25μmol·L-1,Cy5-dCTP2·5μmol·L-1,引物各0.6μmol·L-1,rTaq聚合酶2U,Mg2+2.5

12、mmol·L-1,10×PCR緩沖液4Ml,基因組DNA50～100ng,加去離子水至40μL。
　　 標(biāo)記反應(yīng)程序:93℃5min,55℃2min；93℃30s,55℃45s,70℃45s,循環(huán)35次;70℃7min,4℃保存。
　　 標(biāo)記產(chǎn)物使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
　　 8.雜交、掃描將7μL2×雜交緩沖液、7μL熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與1μL陽性對照引物CCOB(5’-Cy5-CCAATCTCCAGGC

13、ATTGAGCGGGTT-3’)混合,于95℃變性2min,立即冰浴冷卻用移液管將其轉(zhuǎn)移至芯片目標(biāo)區(qū)域,蓋上蓋玻片,55℃雜交2h。雜交完成后,先后以0.2％SDS和水沖洗芯片,放置微干。ScanArray4000芯片掃描儀檢測熒光信號。
　　 結(jié)果：
　　 1.ITS序列
　　 1)18種柴胡屬植物的ITS序列長度范圍599-609bp,G+C％含量為55.9％-59.3％；ITS1區(qū)長度最大相差7bp,G+C

14、％含量為59.8％-64.5％；5.8s rDNA序列長度范圍穩(wěn)定在162-163bp,其中有10種柴胡屬植物G+C％含量為53.4％;ITS2區(qū)長度最大相差4bp,G+C％含量為54.2％-60.8％；ITS1區(qū)的G+C％含量高于ITS2區(qū)。
　　 2)當(dāng)空位(Gap)作為缺失處理時(shí),ITS區(qū)全序列排序后的長度為609位點(diǎn),其中168個(gè)變異位點(diǎn),90個(gè)信息位點(diǎn)。5.8S rDNA變異較小,保守位點(diǎn)占85.3％,ITS區(qū)的變異主

15、要發(fā)生在內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2區(qū)。ITS1、ITS2區(qū)的變異位點(diǎn)為80和64,信息位點(diǎn)分別為21.6％和16.7％,而5.8S rDNA序列中僅有5個(gè)信息位點(diǎn),所以5.8S rDNA區(qū)相對保守。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1+ITS2)對位排列后總長度為446bp,共有144個(gè)變異位點(diǎn),85個(gè)信息位點(diǎn),信息位點(diǎn)比例達(dá)到19.1％。
　　 3)18種柴胡的遺傳距離為0.002-0.159。其中云南采集的竹葉柴胡、窄竹葉柴胡、小柴胡

16、和細(xì)莖有柄柴胡與其它柴胡的遺傳距離為0.091-0.159,新疆采集的金黃柴胡與其它柴胡之間遺傳距離為0.071-0.159。毒芹與柴胡屬植物遺傳距離為0.341-0.406。
　　 4)聚類分析結(jié)果:柴胡屬與毒芹屬分化明顯,各自為一單系樹；多枝柴胡與柴首聚在一起；南方大葉柴胡與大葉柴胡聚在一起；黑柴胡與小葉黑柴胡聚在一起；馬爾康柴胡與四川柴胡、銀州柴胡、北柴胡聚類；窄竹葉柴胡與竹葉柴胡、小柴胡、細(xì)莖有柄柴胡聚類。
　　

17、 2.DNA芯片不同地點(diǎn)采集的同一種柴胡樣品,其雜交圖譜相同。在某些情況下,除預(yù)期的探針位置外,其他探針的位置也會(huì)出現(xiàn)信號。以北柴胡為例,在其雜交圖譜中,探針Sa2和Sa4處同時(shí)出現(xiàn)了熒光斑點(diǎn),但只有Sa2是為其設(shè)計(jì)的,Sa4是為銀州柴胡設(shè)計(jì)的,說明有交叉反應(yīng)出現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)中,每種柴胡都可以通過雜交圖譜得以鑒別,銀州柴胡可以通過Sb1處的信號與北柴胡區(qū)別開。
　　 結(jié)論：
　　 1.18種柴胡品種的ITS序列之間有差異,I