心衰標(biāo)志物NT-proBNP高效免疫傳感器檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、N 末端前鈉尿肽（NT-proBNP），是從其氨基酸前體蛋白（pro-BNP）中的羧基端裂解而來(lái)含76個(gè)氨基酸的非活性多肽，是心衰時(shí)較好的心臟標(biāo)志物，能反映心室容積擴(kuò)大、心室超負(fù)荷和心臟功能有無(wú)損傷及損傷程度[2-5]。早在2000年“Heart”雜志在一篇名為“BNP：很快成為治療心衰患者的常規(guī)措施”的編者社論中就明確認(rèn)為腦鈉肽或B 型鈉尿肽(brain natriuretic peptide, B-type natriuretic

2、peptide; BNP)有助于診斷心衰，可作為心衰患者預(yù)后標(biāo)志物，是一種新的監(jiān)控心衰的方法。2002年，國(guó)際上已經(jīng)公認(rèn)腦鈉肽前體，NT-proBNP，是測(cè)定心衰的一個(gè)劃時(shí)代的具有特異性的標(biāo)志物。目前，NT-proBNP的診斷試劑僅有國(guó)外幾家大型醫(yī)療企業(yè)生產(chǎn)，價(jià)格昂貴，普及推廣較難。同時(shí)，市場(chǎng)上也無(wú)出售能直接用于NT-proBNP 檢測(cè)的抗體及標(biāo)準(zhǔn)品，因此制備研制NT-proBNP 檢測(cè)用抗體及校準(zhǔn)品，對(duì)彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)NT-proBNP 檢測(cè)

3、試劑空白及改善進(jìn)口試劑價(jià)格高昂的狀況，本身就是一項(xiàng)巨大社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工作，同時(shí)也為建立具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的NT-proBNP 電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
　　 近年來(lái)基于免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的免疫傳感器技術(shù)已有很大的發(fā)展，該方法不但能定量分析、且有可能開(kāi)發(fā)出適合社區(qū)醫(yī)院和床旁應(yīng)用的快速檢測(cè)產(chǎn)品，而倍受關(guān)注[6]，由于NT-proBNP的正常人血清含量約0.1ng/ml,心衰時(shí)可達(dá)2-3ng/ml，現(xiàn)有的免疫傳感

4、器技術(shù)通常能檢測(cè)到0.5ng/ml，建立NT-proBNP 可靠的測(cè)定方法應(yīng)該增敏至正常人血清NT-proBNP 含量的下線左右，以及延長(zhǎng)傳感器的使用壽命、解決再生問(wèn)題和檢測(cè)電極的抗干擾能力提高檢測(cè)特異性，以達(dá)到臨床檢測(cè)的要求。為了提高的生物傳感器靈敏度, 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者采用不同的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或者抗體分子，以提高免疫傳感器的靈敏度，并已取得了較好的進(jìn)展[7]。在標(biāo)記物中除了最常用的酶以外，還有金屬或半導(dǎo)體的納米顆粒及其它具有

5、電活性的新型生物材料。我們?cè)谘芯抗ぷ髦校覀兂晒χ苽淞薔T-proBNP免疫檢測(cè)的抗體及可以應(yīng)用于臨床的檢測(cè)校準(zhǔn)品，通過(guò)與Roche 試劑臨床檢測(cè)對(duì)比，符合率達(dá)95％以上。在此基礎(chǔ)上，以磁性微粒子偶聯(lián)抗體結(jié)合本研究制備的可控磁場(chǎng)電極實(shí)現(xiàn)免疫傳感器再生及快速檢驗(yàn)；通過(guò)對(duì)抗體的片段化制備高活性的NT-proBNP Fab抗體應(yīng)用于免疫傳感器檢測(cè)消除非標(biāo)記檢測(cè)中的非特異性物質(zhì)的結(jié)合帶來(lái)的假陽(yáng)性；采用多層碳納米管(CNTs)為NT-proBNP

6、抗體的固相載體提高抗體吸附的表面積，以及金納米鏈與辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物與配對(duì)NT-proBNP抗體結(jié)合的形式信號(hào)放大提高了檢測(cè)靈敏度。通過(guò)以上研究，我們解決了NT-proBNP免疫傳感器檢測(cè)中的一些關(guān)鍵問(wèn)題，為建立NT-proBNP免疫傳感器檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)NT-proBNP的臨床免疫傳感器檢測(cè)產(chǎn)品研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果：
　　 1．心衰標(biāo)志物NT-proBNP免疫檢測(cè)用抗體及校準(zhǔn)品研究

7、　　 1.1檢測(cè)校準(zhǔn)品制備及穩(wěn)定性研究
　　 基因重組大腸桿菌（E.coli BL21DE3）中表達(dá)的純化的人NT-proBNP蛋白，確定最佳的穩(wěn)定保存形式，結(jié)果表明：在含有0.3％ Proclin300的PBS 凍干保存NT-proBNP 6個(gè)月后其檢測(cè)值僅降低<5％，用小牛血清溶解稀釋后一個(gè)月其測(cè)定值僅降低<10％，具有良好的保存及檢測(cè)結(jié)果。
　　 1.2 NT-proBNP 多克隆抗體純化及鑒定
　　 采

8、用多肽偶聯(lián)NHS 活化偶聯(lián)填料建立的親和層析純化及Protein A 普通親和層析結(jié)合的方式建立了的NT-proBNP 多抗純化技術(shù)，將多抗中含量?jī)H1％的特異性IgG 多抗純化出來(lái)，每100毫升免疫血清獲得抗體20毫克左右，純化抗體具有高親和力，同時(shí)具有類(lèi)似單抗的表位特異性。
　　 1.3 NT-proBNP 單克隆抗體的純化及鑒定
　　 預(yù)純化的單抗腹水經(jīng)SiO2的吸附處理，經(jīng)改良的Protein A 填料Mabsel

9、ect 純化，純化抗體SDS-PAGE 電泳純度>95％，能有效去除抗體中的脂蛋白提高NT-proBNP 單抗的純度及特異性，更適宜抗體標(biāo)記及片段化改造。
　　 1.4 NT-proBNP抗體的HRP 標(biāo)記
　　 通過(guò)改良優(yōu)化的HRP 標(biāo)記方法，制備HRP 標(biāo)記的NT-proBNP 單克隆抗體，標(biāo)記的單抗稀釋度達(dá)1:1000000，最終確定1:6000的稀釋度應(yīng)用于雙抗夾心檢測(cè)人NT-proBNP，達(dá)到臨床檢測(cè)效果，標(biāo)記

10、效果良好。
　　 1.5 雙抗夾心檢測(cè)人NT-proBNP 方法學(xué)建立及評(píng)價(jià)
　　 以制備的NT-proBNP 單抗、多抗及檢測(cè)校準(zhǔn)品建立的NT-proBNP 雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其試劑盒檢上限達(dá)到30000pg/ml,下限到100pg/ml，通過(guò)收集的234份臨床標(biāo)本與Roche的電化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)對(duì)照，符合率達(dá)到99％ (P<0.001)，驗(yàn)證抗體檢測(cè)血清中天然NT-proBNP的能力。
　　 2

11、．心衰標(biāo)志物NT-proBNP免疫傳感器特異性與免再生研究
　　 2.1NT-proBNP 單克隆抗體Fab抗體的制備及應(yīng)用
　　 使用木瓜蛋白酶酶切單克隆抗體制備Fab抗體，酶切后采用抗原偶聯(lián)NHS 活化偶聯(lián)填料及Protein A 純化獲得的Fab抗體具有高活性及徹底的除掉Fc 段，采用該方法制備的NT-proBNP Fab抗體純度95％以上，F(xiàn)c 段切除率接近100％。
　　 2.2 Fab抗體應(yīng)用于提高N

12、T-proBNP免疫傳感器特異性
　　 通過(guò)雙單克隆抗體建立的雙抗夾心檢測(cè)人NT-proBNP 方法從收集的40例風(fēng)濕病人血清及216 份陰性體檢血清中分別篩選出6 份和2 份經(jīng)Roche 檢測(cè)為陰性的假陽(yáng)性標(biāo)本，通過(guò)將單克隆抗體Fab 化應(yīng)用于免疫傳感器檢測(cè)，8 份血清均檢測(cè)正常，消除了非標(biāo)記系統(tǒng)免疫傳感器檢測(cè)中因風(fēng)濕因子、補(bǔ)體系統(tǒng)、抗鼠抗體等帶來(lái)的假陽(yáng)性。
　　 2.3 NT-proBNP抗體的生物素化
　　

13、 采用Pierce 生物素化試劑盒對(duì)抗體進(jìn)行生物素化， 選擇EZ-LinkSulfo-NHS-LC-LC-Biotin 標(biāo)記試劑盒，是一種長(zhǎng)臂生物素，分子量為669.75，臂長(zhǎng)30.5，提高檢測(cè)靈敏度。標(biāo)記的抗體采用間接ELISA 檢測(cè)稀釋度達(dá)1:1000000。
　　 2.4免再生NT-proBNP免疫傳感器的構(gòu)建
　　 以親和素包被磁性微粒子為固相載體，捕獲反應(yīng)體系中形成的生物素化抗體-抗原-二抗形成的免疫復(fù)合物，達(dá)

14、到檢測(cè)目的。并通過(guò)自行設(shè)計(jì)的可控磁場(chǎng)電極進(jìn)行檢測(cè)、洗脫、再檢測(cè)的連續(xù)檢測(cè)形式，實(shí)現(xiàn)免再生。
　　 2.5基于Fab抗體構(gòu)建的免再生NT-proBNP免疫傳感器檢測(cè)效果評(píng)價(jià)
　　 在電化學(xué)免疫傳感技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)、構(gòu)建了新型的磁場(chǎng)可控電極，并結(jié)合生物素化NT-proBNP Fab抗體、親和素包被磁性微粒子，實(shí)現(xiàn)了NT-proBNP 標(biāo)準(zhǔn)品及臨床樣本中NT-proBNP的快速、便捷、免再生檢測(cè)。結(jié)果顯示，使用該方法構(gòu)建

15、的免疫傳感器檢測(cè)技術(shù)靈敏度達(dá)到0.03 ng/Ml，線性范圍0.04～2.5 ng/Ml，相關(guān)系數(shù)R=0.9827，具有良好的檢測(cè)效果；Fab抗體較全抗體消除了收集的8 份假陽(yáng)性血清；同時(shí)，該檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)免疫傳感技術(shù)由器材向試劑化發(fā)展的轉(zhuǎn)折，便捷化、實(shí)用化，為電化學(xué)免疫傳感技術(shù)向臨床應(yīng)用過(guò)渡研究奠定了工作基礎(chǔ)。
　　 3．心衰標(biāo)志物NT-proBNP免疫傳感器超敏檢測(cè)研究
　　 3.1多層碳納米管(CNTs)固相

16、載體的制備及應(yīng)用
　　 為了將多層碳納米管能有效的固定與檢測(cè)電極表面，我們采用非共價(jià)結(jié)合的方式先酸處理CNTs，然后結(jié)合BSA。結(jié)合BSA蛋白的CNTs能被吸附在金電極表面，同時(shí)避免用共價(jià)方式結(jié)合后CNTs 電子傳遞受影響的后果，并且結(jié)合BSA后的金電極可進(jìn)一步與膠體金結(jié)合，偶聯(lián)目的抗體分子。通過(guò)循環(huán)伏安法（CV）考察，所制備的電極具有良好的電流響應(yīng)性。
　　 3.2 金納米鏈、辣根過(guò)氧化物酶與二抗復(fù)合物的制備及應(yīng)用

17、r>　　 以抗壞血酸為反應(yīng)媒介，促進(jìn)HAuCl4溶液與NT-proBNP 二抗及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）形成鏈狀復(fù)合物。通過(guò)透射電鏡（TEM）考察其制備效果，結(jié)果達(dá)到預(yù)計(jì)效果。對(duì)比普通膠體金結(jié)合二抗，極大的提高了檢測(cè)靈敏度。
　　 3.3基于多層碳納米管及金納米鏈與辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物構(gòu)建的NT-proBNP免疫傳感器檢測(cè)效果評(píng)價(jià)
　　 采用多層碳納米管(CNTs)為固相載體提高吸附表面積，增加電極表面一抗固定量，同時(shí)

18、以及金納米鏈與辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物與二抗結(jié)合的形式信號(hào)放大，達(dá)到雙重放大效應(yīng)，極大的提高了檢測(cè)靈敏度。通過(guò)循環(huán)伏安法（CV）考察了電極表面的電化學(xué)特性，并對(duì)該免疫傳感器的性能進(jìn)行了詳細(xì)的研究。研究結(jié)果顯示，該傳感器檢測(cè)靈敏度達(dá)到6pg/Ml，線性范圍為0.02-100ng/Ml（R=0.997），明顯高于NT-proBNP 臨床檢測(cè)的靈敏度要求（0.1ng/Ml）。同時(shí)對(duì)該免疫傳感器也被研究證實(shí)具有良好的選擇性和再生性能等，為進(jìn)一步研究