以EDC-NHS為交聯(lián)劑的絲素蛋白基大孔微載體的制備與研究.pdf

1、研究背景:急慢性肝衰治療是目前臨床醫(yī)學急待解決的重大課題之一,每年約有近30萬患者死于此癥。盡管內科治療已取得長足的進步,但仍只有不到30％的患者能夠存活。肝移植技術是目前治療肝衰最有效的辦法,但由于供肝缺乏,其發(fā)展受到極大的制約。而肝臟組織工程為肝病的終末期治療帶來了新的希望。肝組織工程作為構建可植入肝的創(chuàng)新方法,具有緩解器官供體短缺的潛能。組織工程學是20世紀80年代末發(fā)展起來的一門新興交叉學科,組織工程的基本含義是應用工程學和生命

2、科學的基本原理和技術,在體外構建具有生物功能的人工取代物,用于修復組織缺損,替代失去功能或衰竭的組織、器官的部分或全部功能。近年來,隨著生命科學、材料科學和工程科學的發(fā)展,科研人員相繼在多種組織、器官體外再造的研究方面取得突破性進展,其中,一些組織工程產品如軟骨、皮膚已實現(xiàn)商品化。其核心是建立細胞與生物材料的三維空間復合體,即具有生命力的活體組織,用以對病損組織進行形態(tài)、結構和功能的重建并達到永久性替代。主要研究內容包括種子細胞的選取,

3、細胞外基質材料(即支架材料)以及組織和器官的構建與再生。肝細胞是具有極性的錨定依賴性細胞,需要一種不溶的細胞外基質才能獲得生存、重組、增殖并發(fā)揮功能,支架材料的生物相容性和細胞黏附能力是至關重要的。近幾年來,人們逐漸認識到基質材料在其中占有重要地位,基質材料既是信號分子或細胞的載體,又是新生組織生長的支架。理想的支架材料應具有以下特性:三維多孔的連接網(wǎng)絡,有利于細胞生長、養(yǎng)分傳輸和代謝產物的排放；生物相容性和可降解性好,降解速度和吸收速

4、度可以調控,以適應細胞或組織在體內和體外的生長；化學表面適合細胞的黏附、增殖和分化；機械性能與所植入的組織的要求相匹配。因此,尋找適宜的基質材料,是組織工程研究中的一個重要內容。近年來微載體在生物人工肝及組織工程領域的應用研究正日趨升溫,主要是利用微載體懸浮培養(yǎng)技術進行種子細胞的擴增和用來充當體內細胞治療的傳輸載體。相比于實心微載體,大孔微載體的優(yōu)勢在于為細胞提供了足夠的生長空間和更大的附著面積,有利于營養(yǎng)成分的進入和代謝產物的排出,提

5、高了細胞培養(yǎng)密度和代謝活性。隨著對組織工程支架材料研究的深入,研究人員發(fā)現(xiàn)對高分子材料進行適當?shù)幕瘜W改性、表面修飾等處理可誘導和提高肝細胞在支架材料上的黏附和增殖行為。在肝組織工程支架方面,以半乳糖基修飾各種天然的和人工聚合物,通過肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體和聚合物鏈上高濃度的半乳糖基之間獨特的分子識別功能,可以提高肝細胞的特異功能。半乳糖基是肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor,ASG

6、PR)的特異性配體,是肝細胞識別的相應位點并能產生特異性相互作用。在肝組織工程細胞外基質支架材料上引入半乳糖基,可誘導和提高肝細胞在細胞外基質支架材料上的黏附和增殖行為。本課題組的前期研究中已成功地以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸等為原料,首先在殼聚糖上接枝半乳糖基,然后將絲素蛋白(Silk Fibroin)與半乳糖基化殼聚糖(Galactosylated Chitosan)復合,將半乳糖基引入材料中,制備出了一種具有肝細胞特異性的高性能的大

7、孔微載體。目前肝組織工程大多采用復合材料作為支架材料,通過化學交聯(lián)的方法一般能獲得理想的、均勻一致的交聯(lián)強度,但交聯(lián)劑的選擇非常關鍵。戊二醛是最常用的交聯(lián)氨基酸交聯(lián)劑,但戊二醛殘留質量濃度在低至3.0 mg/L時仍有毒性。水溶性1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(C8H17N3·HCl,EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(C4H5NO3,NHS)是一種新型無毒、生物相容性良好的交聯(lián)劑,可促發(fā)膠原發(fā)生交聯(lián),形成酰胺鍵。交聯(lián)過程中ED

8、C、NHS不進入最終產物中,而是轉變成水溶性的脲衍生物,因此細胞毒性很小,以之作為交聯(lián)劑制備肝組織工程的支架材料有望在生物相容性及提高肝細胞功能方面得到優(yōu)化。
　　 目的:以絲素蛋白、殼聚糖、乳糖酸等為原料,以完全無毒的EDC/NHS為交聯(lián)劑,將絲素蛋白(Silk Fibroin)與半乳糖基化殼聚糖(Galactosylated Chitosan)復合交聯(lián),制備出一種生物相容性良好并具有肝細胞特異性的高性能的大孔微載體。并通過M

9、TT測試及細胞功能測試等研究該新型大孔微載體的生物相容性。
　　 方法:首先通過查閱文獻初步確定以EDC/NHS交聯(lián)絲素與殼聚糖的初步劑量,并通過預實驗初步將交聯(lián)劑量分為高、中、低三個組。然后制備出絲素蛋白水溶液和半乳糖基化殼聚糖溶液。將絲素蛋白水溶液與GC溶液按照一定比例混合后隨機分成三組,分別加入高、中低三種劑量交聯(lián)劑,再通過乳化-化學交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥后得到低、中、高三組交聯(lián)劑劑量的SF/GC大孔微載體。分別測定

10、三組微載體的直徑及孔徑大小、密度及吸水率并通過倒置顯微鏡及電鏡等觀察微載體形態(tài)。再將EDC/NHS作為交聯(lián)劑制備出的SF/GC大孔微載體作為實驗組,以戊二醛為交聯(lián)劑制備出的SF/GC大孔微載體作為對照組,分別運用MTT法比較其生物毒性。將實驗組與對照組分別于永生化肝細胞系C3A細胞共培養(yǎng)比較其共培養(yǎng)后的細胞功能,所得數(shù)據(jù)均運用SPSS13.0軟件進行分析,P<0.05有意義。
　　 結果:本課題以生物相容性良好的天然高分子材料絲

11、素蛋白、殼聚糖為原料,在首先成功地在殼聚糖上接枝了半乳糖基。然后以EDC/NHS為交聯(lián)劑將SF與GC復合,應用乳化-化學交聯(lián)、極性溶液處理、冷凍干燥等方法制備出了一種肝細胞特異性SF/GC大孔微載體。通過比較不同的交聯(lián)劑劑量后發(fā)現(xiàn)當交聯(lián)劑劑量為EDC:0.6g、NHS:0.14g時微載體的直徑為200-400μm,孔徑為40-80μm,密度為1.03-1.08g/ml,最適合肝細胞生長。通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察該大孔微載體表面呈

12、多孔結構,開口向外,呈喇叭狀,孔的分布均勻,內部亦為多孔結構,適合于肝細胞旋轉微重力培養(yǎng)及攪拌培養(yǎng)。通過分別比較實驗組SF/GC大孔微載體和以對照組SF/GC大孔微載體的MTT測試后發(fā)現(xiàn),三個實驗組大孔微載體的細胞活力存在顯著差異(F=312.920,P<0.001)。根據(jù)OD值變化曲線可以看出實驗組的細胞活力顯著高于對照組而與空白對照組則無顯著差異。通過比較實驗組和對照組微載體與C3A細胞共培養(yǎng)后的細胞功能結果發(fā)現(xiàn)實驗組微載體的葡萄糖

13、消耗濃度顯著的高于對照組(F=96.915,P<0.001),而白蛋白的分泌量則無顯著差異。實驗組微載體與C3A細胞共培養(yǎng)后隨共培養(yǎng)時間的延長 ALT(F=61.375,P<0.001)與AST(F=13.962,P=0.001)的漏出量均顯著低于對照組。
　　 結論
　　 (1)以絲素蛋白、殼聚糖為原料,通過對殼聚糖進行半乳糖基化修飾,然后以完全無毒的EDC/NHS為交聯(lián)劑將SF與GC復合,應用乳化-化學交聯(lián)、極性溶液

14、處理、冷凍干燥等方法可制備出生物相容性良好并具有肝細胞特異性親和力的SF/GC大孔微載體；
　　 (2)當交聯(lián)劑劑量為EDC:0.6g、NHS:0.14g時制備出的微載體直徑為200-400μm,孔徑為40-80μm,密度為1.03—1.08g/ml,最適合肝細胞生長。通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察該大孔微載體表面呈多孔結構,,開口向外,呈喇叭狀,孔的分布均勻,內部亦為多孔結構,適合于肝細胞高密度培養(yǎng)。最適合肝細胞生長。