假高粱及近似種的醇溶蛋白電泳和PCR鑒定.pdf

1、假高粱[Sorghum halepense(L．)Pers]是世界十大惡性雜草之一，被我國列為進(jìn)境植物危險性有害生物。它有多個近似種，如黑高粱(S.almum)、光高粱(S.nitidum)、擬高粱(S.propinquum)、蘇丹草(S.sudanense)和二色高梁(S. bicolor)等，在形態(tài)特征上極為近似，給鑒定帶來了很大的難度；同時由于假高粱及近似種的種子往往夾雜在進(jìn)出境的農(nóng)產(chǎn)品中傳播，其形態(tài)特征往往會因運(yùn)輸過程中的顛簸磨

2、損而不完整或完全丟失，給準(zhǔn)確鑒定假高粱及其近似種帶來了很大的不確定性。為快速準(zhǔn)確的檢測假高粱及其近似種，本文在分析醇溶蛋白SDS-PAGE和DNA序列差異的基礎(chǔ)上，建立了假高粱及其近似種的醇溶蛋白電泳和PCR檢測方法。 參考國際種子協(xié)會(ISTA)推薦的醇溶蛋白研究方法，以高粱種子為材料，大麥、小麥、玉米等為參照，研究了不同提取劑、提取劑用量、濃度和還原劑濃度對高粱種子醇溶蛋白提取的影響。蛋白濃度測定和SDS-PAGE電泳表明，

3、60％叔丁醇加入4％DTT、樣品質(zhì)量比提取劑用量為1:8(g/mL)為提取高梁種子醇溶蛋白的最佳條件。該條件下，提取高梁屬不同種的種子醇溶蛋白，得到的高粱屬種子醇溶蛋白的“指紋”圖譜表明，種間醇溶蛋白譜帶的條帶數(shù)、帶型以及深淺度存在差異，可以用來區(qū)分高粱屬內(nèi)各種。 據(jù)GenBank中二色高粱的一段927Kb的ChiB DNA序列設(shè)計一對通用引物D16/D18，PCR擴(kuò)增并分析了假高粱及其近似種ChiB序列的差異，結(jié)果表明，假高粱

4、與黑高粱的擴(kuò)增產(chǎn)物為567-607bp，親緣關(guān)系較近達(dá)97.5-100％，聚類分為一組；擬高粱、二色高粱等聚為一組，它們之間的相似度為95.1-97.6％；光高粱的遺傳距離最遠(yuǎn)，與其他供試材料的相似度只有72.3-74.7％，自為一組。根據(jù)序列分析結(jié)果設(shè)計了特異引物D51/D55，可以鑒定檢疫性雜草假高粱和黑高粱。 根據(jù)高粱屬核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，設(shè)計引物S3/S9，PCR擴(kuò)增和分析結(jié)果表明，二色高粱、喀麥隆高粱、假

5、高粱、黑高粱的ITS部分序列長度為597bp，擬高粱的長度為598bp，屬于同一組，親緣關(guān)系較近為98.8-100％，多色高粱的長度為598bp，光高粱為602bp，二者親緣關(guān)系較近為96.9-97.2％。序列分析結(jié)果支持將光高粱也歸為多色高粱所在的擬似高粱區(qū)組。在分析序列的基礎(chǔ)之上，設(shè)計的光高粱鑒定引物N3/N5，可以將光高粱從其它近似種中區(qū)分開來。利用乙醇脫氫酶1(Adh1)部分序列設(shè)計引物SW11/SW17，SW22/SW24，S