轉(zhuǎn)HvNHX1基因枸杞植株的獲得及耐鹽性分析.pdf

1、土壤鹽漬化嚴(yán)重影響植物的生長和發(fā)育，制約著當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，提高作物的耐鹽性已成為一個(gè)日益緊迫的研究課題。隨著分子生物學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)液泡膜Na+/H+離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+區(qū)隔化在液泡，是植物抵御鹽脅迫的主要方式之一，在植物耐鹽方面起著非常重要的作用。目前國內(nèi)外已有利用液泡膜Na+/H+離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)化農(nóng)作物，并獲得的耐鹽能力相對提高的轉(zhuǎn)基因植株的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用基因工程手段將HvNHY1基因?qū)雽幭闹匾慕?jīng)濟(jì)作物枸

2、杞中，提高枸杞耐鹽能力，為提高枸杞產(chǎn)量、鹽堿的改良和擴(kuò)大利用提供了很好的途徑。
　　 以枸杞葉片為外植體，優(yōu)化出一套完整、高效的枸杞葉片再生體系。最佳的愈傷組織、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L；最佳的分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.3mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.6 mg/L+NAA0.2mg

3、/L+蔗糖15g/L+瓊脂7g/L；
　　 利用電擊法，將重組質(zhì)粒pSMNHX導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，成功獲得工程菌LBA4404-pSM-NHX。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將HvNHX1基因?qū)氲綄幭蔫坭街?，對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，確定了最終的轉(zhuǎn)化條件：抑菌劑替卡西林的較適濃度為200-300mg/L，卡那霉素較適濃度為50mg/L。農(nóng)桿菌侵染濃度在OD0.4-0.6之間、侵染6min、共培養(yǎng)3d的轉(zhuǎn)化效果最好。
　　 對

4、侵染葉片進(jìn)行再生培養(yǎng)，最終篩選出24株卡那霉素抗性枸杞，對其進(jìn)行PCR檢測，有9株顯示陽性，轉(zhuǎn)化率為38%。后對長勢健康的6株陽性苗進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明HvNHX1已經(jīng)成功整合到枸杞基因組中，并在RNA水平上得到表達(dá)。
　　 對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行NaCl脅迫試驗(yàn)，用NaCl(0%、0.7%、1.2%、1.5%)溶液澆灌10d后測定轉(zhuǎn)基因枸杞和非轉(zhuǎn)基因枸杞的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(M

5、DA)、葉片Na原子含量等生理指標(biāo)的變化，結(jié)果表明：鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株的SOD、POD活性均比對照高，且同一轉(zhuǎn)基因植株在不同鹽濃度下SOD、POD活性變化幅度較對照小，說明轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的耐受能力較強(qiáng)，受到的活性氧傷害較小。同濃度下，轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量要比非轉(zhuǎn)基因植株少，表明轉(zhuǎn)基因植株的受到的膜脂過氧化作用較弱，因此產(chǎn)生了比對照少的MDA。葉片Na原子含量測定結(jié)果表明：鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的Na原子含量隨著鹽濃度的增大而增加