AtNHX1基因?qū)κw麥的遺傳轉(zhuǎn)化及抗鹽再生植株的獲得.pdf

1、蕎麥?zhǔn)寝た?、蕎麥屬雙子葉作物，全世界范圍內(nèi)只有普通蕎麥和韃靼蕎麥兩個(gè)栽培種。蕎麥籽粒中富含黃酮、類(lèi)黃酮、固醇和硫胺類(lèi)結(jié)合蛋白，它們對(duì)一些慢性疾病具有潛在的療效。蕎麥中80％的類(lèi)黃酮物質(zhì)是蘆丁，即蕓香甙(槲皮素-3-蕓香葡糖甙)，它能夠降低血壓和血管的通透性，防止動(dòng)脈硬化和毛細(xì)管脆性增加引起的出血癥，并具有抗浮腫和抗氧化活性。 蕎麥?zhǔn)菍?duì)鹽敏感的淡土植物，土壤中的鹽分對(duì)蕎麥的生長(zhǎng)和產(chǎn)量有較大的影響，因此培育耐鹽的蕎麥品種具有現(xiàn)實(shí)的意

2、義。將抗鹽基因轉(zhuǎn)移到受體植物基因組中，是改善受體植物鹽脅迫耐受能力的主要途徑之一。 本實(shí)驗(yàn)以蕎麥子葉和下胚軸為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織并獲得再生植株，同時(shí)建立起一套有效的蕎麥轉(zhuǎn)化體系，為蕎麥的遺傳改良和基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。在附加2.0 mg/L 6.BA、0.1 mg/LAA和1 mg/L KT的MS培養(yǎng)基上，愈傷組織可以間接分化形成大量的不定芽。通過(guò)對(duì)外植體轉(zhuǎn)化頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、感染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和農(nóng)桿菌加

3、入方式等不同因素對(duì)LBA4404菌株(含有pHZX1質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化蕎麥的影響。結(jié)果表明外植體預(yù)培養(yǎng)2d、浸染20～25min、共培養(yǎng)1～2d可以得到較多數(shù)量的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的另一個(gè)因素乙酰丁香酮(AS)對(duì)蕎麥轉(zhuǎn)化頻率沒(méi)有明顯影響。利用優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系，將擬南芥液泡膜Na<'+>/H<'+>逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到蕎麥中，在附加2.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L IAA、1 mg/L KT

4、、50 mg/L卡那霉素和500 mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)PCR、RT-PCR、Southem印跡和Northem印跡分析，初步證實(shí)AtNHX1基因已整合至蕎麥基因組。用200mmol/L的鹽水對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株脅迫處理6周，轉(zhuǎn)基因植株能夠生存，而對(duì)照植株死亡。用不同濃度的NaCl溶液處理轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株，發(fā)現(xiàn)Na<'+>在轉(zhuǎn)基因植株葉片中的積累水平顯著高于對(duì)照植株。次生代謝產(chǎn)物黃酮類(lèi)化合物