體外光化學(xué)治療誘導(dǎo)人體免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前器官移植已成為治療相應(yīng)器官嚴(yán)重功能障礙的重要手段。肝移植是目前治療各種終末期肝病唯一有效的方法。免疫抑制劑的使用是預(yù)防肝移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的主要手段，但也能引起患者機(jī)體代謝的失衡和許多副作用。如何減少肝移植受者免疫抑制劑的使用，已經(jīng)成為移植學(xué)家們追求的目標(biāo)。體外光化學(xué)療法(extracorporealphotopheresis，ECP)于1987年引進(jìn)國(guó)內(nèi)并用于治療器官移植排斥反應(yīng)，臨床觀察到有一定的療效。ECP是指將患者外周血處

2、理后并從中分離出單個(gè)核細(xì)胞，再經(jīng)光敏劑8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen，8-MOP)和長(zhǎng)波紫外線(long wave ultraviolet，UVA)聯(lián)合作用后回輸入病人體內(nèi)的一種血液?jiǎn)尾晒饣瘜W(xué)療法。但ECP作用的具體機(jī)制至今尚未清楚。越來(lái)越多的證據(jù)表明，ECP主要是抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)的功能調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）的誘

3、導(dǎo)作用。在體內(nèi)凋亡細(xì)胞攝取的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生免疫抑制調(diào)節(jié)作用也是ECP發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。ECP在以往的研究中主要集中在誘導(dǎo)移植受者的免疫耐受。我們首次用肝移植供者的脾臟和外周血為實(shí)驗(yàn)材料，研究脾淋巴細(xì)胞的凋亡，和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imature dendritic cells，imDC)的生成，有一定的創(chuàng)新性且有助于進(jìn)一步更好的研究受者的免疫耐受機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)就聯(lián)合應(yīng)用UVA和8-MOP誘導(dǎo)肝移植供者脾淋巴細(xì)胞的早期凋亡，并用供

4、-者的外周血經(jīng)rhGM-CSF、IL4誘導(dǎo)產(chǎn)生imDC，旨在為進(jìn)一步研究移植受者的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　1、UVA聯(lián)合8-MOP誘導(dǎo)人脾淋巴細(xì)胞凋亡
　　首先獲取肝臟移植供者的脾臟（人脾臟來(lái)源于解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科肝臟移植供者，肝源供者已簽署相關(guān)知情同意書并經(jīng)309醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)移植的系列規(guī)定），制備成淋巴細(xì)胞懸液，根據(jù)處理方式不同分為單純UVA處理組(UVA組)

5、、單純8-MOP處理組（8-MOP組）、UVA聯(lián)合8-MOP處理組（聯(lián)合組）、未經(jīng)UVA照射和未添加8-MOP處理組（空白對(duì)照組）。每組3例（多次進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)）。UVA組于37℃50 mL/L CO2孵箱中孵育20 min，采用照射強(qiáng)度為2 J/cm2的光照輻射儀在無(wú)菌照射臺(tái)上照射9 min，距UVA光源距離為20cm;8-MOP組先加入200 ng/mL8-MOP，再置于37℃50 mL/L CO2孵箱中孵育20 min;聯(lián)合組先加入

6、200 ng/mL8-MOP，置于37℃50 mL/L CO2孵箱中孵育20 min后再將此人脾淋巴細(xì)胞懸液放于照射強(qiáng)度為2 J/cm2，距UVA光源20 cm的無(wú)菌照臺(tái)上，照射9 min;空白對(duì)照組僅單純培養(yǎng)人脾淋巴細(xì)胞。將上述不同處理后的人脾淋巴細(xì)胞懸液用RPMI1640培養(yǎng)液1200 r/min離心5 min，反復(fù)洗滌2次，再用RPMI1640完全培養(yǎng)基（含100 mL/L胎牛血清）重懸細(xì)胞懸液，置于37℃50mL/L CO2孵箱

7、中培養(yǎng)過(guò)夜。24h后用annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒各組進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)不同處理后的人脾淋巴細(xì)胞的早期凋亡率。
　　2、肝移植供者外周血制備未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞
　　首先獲取肝移植供者的外周血約10ml（血液來(lái)源于解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科肝臟移植供者，肝源供者已簽署相關(guān)知情同意書并經(jīng)309醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)移植的系列規(guī)定），等量置于兩個(gè)15ml離心管內(nèi)，

8、標(biāo)記為誘導(dǎo)組和對(duì)照組，分別加入等量的人外周血淋巴細(xì)胞分離液，分離出單個(gè)核細(xì)胞，再分別加10mlRPMI1640洗滌兩次后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，保證細(xì)胞存活率＞95％。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/L，分別接種于兩個(gè)6孔培養(yǎng)板（誘導(dǎo)組6例，對(duì)照組6例），置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，清除懸浮細(xì)胞，兩組均加入rhGM-CSF(500u/ml)2ul、rhIL-4(1000u/ml)8ul吹打，混勻;48h后兩組均半量換液，加入

9、rhGM-CSF(500u/ml)1ul、rhIL-4(1000u/ml)4ul吹打，混勻;96h后誘導(dǎo)組保持不變，對(duì)照組加入rhTNF-α3ul吹打，混勻，培養(yǎng)2天。在培養(yǎng)第6天，光鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)特征，再分別收取各組的6個(gè)培養(yǎng)孔的貼壁細(xì)胞。用PE或FITC標(biāo)記的CD80、CD83、CD11a和CD86抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的表型。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、UVA聯(lián)合8-MOP誘導(dǎo)人脾淋巴細(xì)胞凋亡:聯(lián)合組的人脾淋巴細(xì)胞的早期凋

10、亡率為（98.45±0.54）％，明顯高于其他三組(P＜0.01)。UVA組和8-MOP組均高于對(duì)照組(P＜0.01)。各組的總凋亡率和早期凋亡率:聯(lián)合組的總凋亡率和早期凋亡率分別為（99.36±0.39）％，(98.45±0.54)％;8-MOP組分別為(69.55±0.46)％，（64.68±0.74）％;UVA組的分別為（65.42±0.36）％，(61.05±0.90)％;對(duì)照組分別為（15.53±0.45）％，（13.67±0

11、.54）％。
　　2、肝移植供者外周血制備未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞:光鏡下可見(jiàn)，培養(yǎng)第6天時(shí)，誘導(dǎo)組細(xì)胞呈圓形，突起較少，呈現(xiàn)imDC狀態(tài)。對(duì)照組細(xì)胞外周可見(jiàn)突起和絨毛，表面結(jié)構(gòu)較完整，樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)明顯，呈現(xiàn)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞(mature dendritic cells，mDC)的狀態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞的表型:誘導(dǎo)組在培養(yǎng)第6d檢測(cè)CD80為（22.63±3.56）％，CD86為（16.39±4.72）％，CD83為（8.58±1

12、.72）‰CD11c為（70.56±10.22）％，符合imDC的表現(xiàn);對(duì)照組在培養(yǎng)6d時(shí)檢測(cè)CD80含量為（53.82±5.46）％，CD86含量為（46.65±6.35）％，CD83含量為（80.56±16.45）％，CD11c含量為（82.32±11.61）％，符合mDC的表現(xiàn)。可見(jiàn)，誘導(dǎo)組樹(shù)突狀細(xì)胞的CD80、CD86、CD83、CD11c的含量均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，且在光鏡下呈現(xiàn)出imDC的狀態(tài)。兩組檢測(cè)指標(biāo)和細(xì)胞

13、的形態(tài)相符合。由此可知，用rhGM-CSF聯(lián)合rhIL-4的培養(yǎng)方法可成功用肝移植供者的外周血培養(yǎng)出imDC。
　　本實(shí)驗(yàn)用ECP方法成功誘導(dǎo)出大量人脾臟凋亡細(xì)胞，尤其是早期凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著高于其他各個(gè)處理組和空白對(duì)照組。在體外用rhGM-CSF+rhIL-4的方法可成功用肝移植供者的外周血培養(yǎng)出imDC，且在光鏡下呈現(xiàn)imDC的形態(tài)特征。早期凋亡人脾淋巴細(xì)胞和imDC在肝移植受者的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用中至關(guān)重要，我們前期的實(shí)驗(yàn)