人血清免疫球蛋白類定時(shí)散射比濁檢測(cè)系統(tǒng)的研制.pdf

1、人體內(nèi)存在著10萬(wàn)種以上的蛋白質(zhì)，在機(jī)體中承擔(dān)著不同的任務(wù)，來(lái)源于組織細(xì)胞，對(duì)維持人體機(jī)能變化起著重要的作用，當(dāng)疾病狀態(tài)時(shí)又起著重要病理意義的那些特殊蛋白，統(tǒng)稱為特定蛋白。為了揭示生命活動(dòng)的規(guī)律，識(shí)別和檢測(cè)這些蛋白質(zhì)以及生理功能是必然的發(fā)展方向。人體免疫系統(tǒng)中也存在著這樣一類與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后緊密關(guān)聯(lián)的特定蛋白，包括免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、以及補(bǔ)體C3、C4。人體免疫系統(tǒng)

2、是人類保持健康、避免發(fā)生各種疾病的自衛(wèi)防御系統(tǒng)，它是人類在進(jìn)化過(guò)程里，與自然環(huán)境作斗爭(zhēng)中逐漸建立和完善的，是一個(gè)組織嚴(yán)密、分工精細(xì)，成員眾起各種疾病時(shí)，具有抵抗力，確保人體內(nèi)環(huán)境的統(tǒng)一、穩(wěn)定和平衡。人體內(nèi)免疫功能失調(diào)會(huì)引起惡性腫瘤、慢性腎病、慢性肝炎、慢性胃病、糖尿病、紅斑狼瘡、風(fēng)濕性心臟病、硬化癥、重癥肌無(wú)力、類風(fēng)濕、中老年性疾病等各種免疫系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康，隨著社會(huì)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)科技的不斷進(jìn)步，越來(lái)越多的免疫系統(tǒng)疾病被人們

3、所重視，與其密切相關(guān)的特定蛋白的檢測(cè)也日益受到廣大醫(yī)學(xué)和科研工作者的青睞及關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外常用的特定蛋白的檢測(cè)方法包括單向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法、酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)、時(shí)間分辨免疫測(cè)定(TRFIA)、透射比濁法等，但是這些方法都存在一定的弊端，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，不易自動(dòng)化，因此檢測(cè)時(shí)不僅將增加被檢測(cè)者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也使檢測(cè)者耗費(fèi)更多時(shí)間、精力和試劑。
　　 隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，特種蛋白分析技術(shù)由最

4、初的試管沉淀反應(yīng)、瓊脂凝膠的擴(kuò)散試驗(yàn)，發(fā)展到現(xiàn)代免疫分析技術(shù)，特種蛋白免疫分析技術(shù)方法逐步完善，其靈敏度逐步提高，檢測(cè)水平由微克(μ g)發(fā)展到納克(ng)，甚至皮克(pg)水平。特種蛋白分析儀是近年來(lái)國(guó)內(nèi)常購(gòu)的用于檢測(cè)特種蛋白的臨床檢驗(yàn)設(shè)備。特定蛋白分析儀是利用抗原-抗體在一定條件下反應(yīng)形成免疫復(fù)合物的原理，用免疫濁度法檢測(cè)懸浮于緩沖液中的抗原-抗體免疫復(fù)合物顆粒的定量測(cè)定方法。特種蛋白分析儀從結(jié)構(gòu)上主要分為透射比濁和散射比濁。

5、>　　 免疫比濁測(cè)定法(Immunoturbidimetry)具備生化檢測(cè)的快速性和免疫分析的特異性，是將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器與自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)的方法，可對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物以及小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。與其它免疫分析方法相比，免疫比濁技術(shù)除了具有操作簡(jiǎn)單、靈活、檢測(cè)范圍廣，易于自動(dòng)化等顯著特點(diǎn)，其最突出優(yōu)勢(shì)還在于克服了抗原過(guò)量引起的高劑量HOOK效應(yīng)。最早可追溯到1967年，Ritchie等報(bào)道了

6、散射比濁法(Nephelometry)，其原理是光線通過(guò)檢測(cè)溶液時(shí)，被其中所含的抗原抗體復(fù)合物折射而部分發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。根據(jù)雷利散射公式，在一定條件下，透射光與微粒濃度成反比，散射光與微粒濃度成正比。散射比濁法可分為終點(diǎn)和速率散射比濁法及動(dòng)態(tài)定時(shí)散射比濁法。而散射免疫比濁測(cè)定法，具有線性范圍寬廣，測(cè)定速度快，精密度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并可批量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，是一種微量、快速、自動(dòng)化檢測(cè)體液中特定蛋白質(zhì)成分的免疫化學(xué)分

7、析技術(shù)。
　　 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)隨著臨床檢測(cè)需求的增加，免疫比濁測(cè)定方法的應(yīng)用也越來(lái)越普遍，因此對(duì)相應(yīng)試劑及緩沖液的的使用也呈廣泛趨勢(shì)，但是由于國(guó)內(nèi)臨床使用的儀器基本依賴于進(jìn)口，這就引發(fā)了一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，這些儀器大多都只能使用它們自己的原裝試劑和緩沖液，而且大都價(jià)格昂貴，不適宜大批量長(zhǎng)期使用，使其在臨床使用局限化。如果能研制出與儀器配套的試劑及緩沖液，將為臨床檢驗(yàn)解決一個(gè)重大難題。目前國(guó)內(nèi)也有公司進(jìn)行這方面的研究，但是都不盡人意，只

8、是停留在起步階段。這就決定了開發(fā)配套國(guó)產(chǎn)試劑及其相關(guān)緩沖液具有巨大的市場(chǎng)前景，填補(bǔ)了國(guó)產(chǎn)試劑的空缺，可以推動(dòng)國(guó)內(nèi)臨床檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步。鑒于臨床上對(duì)特定蛋白檢測(cè)的必要性以及目前檢測(cè)手段的局限性，我們的研究目的是研制出能應(yīng)用于散射免疫比濁技術(shù)的國(guó)產(chǎn)相關(guān)檢測(cè)試劑和緩沖液，滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求，并為廣大臨床患者帶去福音。
　　 本實(shí)驗(yàn)室采用的是動(dòng)態(tài)定時(shí)散射比濁法(Fixed-Time Nephelometric AssayFTNA)，該

9、方法的原理：由于免疫沉淀反應(yīng)是在抗原抗體相遇后立即開始，在極短時(shí)間內(nèi)反應(yīng)介質(zhì)中散射信號(hào)變動(dòng)很大，此時(shí)計(jì)算峰值信號(hào)會(huì)產(chǎn)生一定誤差。故在抗原抗體反應(yīng)時(shí)留出預(yù)反應(yīng)時(shí)間，即散射光信號(hào)第一次讀數(shù)在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)，大多數(shù)情況下2min以后測(cè)第二次讀數(shù)，并從第二次讀數(shù)中扣除第一次讀數(shù)，最后轉(zhuǎn)換為待測(cè)抗原濃度。抗原、抗體劑量.反應(yīng)曲線是由Heidelberger首次發(fā)現(xiàn)，在抗體過(guò)量階段，沉淀物的量隨著抗原濃度成比例增加，當(dāng)抗原濃度的增加不

10、再增強(qiáng)信號(hào)時(shí)，就達(dá)到了平衡點(diǎn)。進(jìn)一步增加抗原的量會(huì)導(dǎo)致沉淀物總量減少。當(dāng)抗原濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)所有抗體結(jié)合容量時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可溶性物質(zhì)，接著互相交聯(lián)形成的沉淀物無(wú)法檢測(cè)。在抗原過(guò)量區(qū)域，所有具有較大病理學(xué)濃度范圍的人體蛋白，都受到這種現(xiàn)象的影響。Green等根據(jù)反應(yīng)曲線的形狀提出了“鉤狀效應(yīng)(Hook Effect)”的名稱。目前鉤狀效應(yīng)主要針對(duì)抗原過(guò)剩而言，我們運(yùn)用的BN Prospec特種蛋白儀方法學(xué)上較其他儀器具有明顯的優(yōu)勢(shì)：動(dòng)態(tài)定時(shí)散射

11、比濁、前向全散射的光收集和乳膠增強(qiáng)試劑使靈敏度提高十倍。此外，儀器還具有抗原過(guò)剩的自動(dòng)稀釋檢測(cè)功能，間接抗原過(guò)量檢測(cè)，避免了高劑量Hook效應(yīng)造成的假陰性結(jié)果，檢測(cè)的范圍也更寬廣。本研究應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)原理利用動(dòng)態(tài)定時(shí)散射比濁分析技術(shù)監(jiān)測(cè)人血清中的免疫球蛋白系統(tǒng)類相關(guān)蛋白的含量，以此來(lái)評(píng)價(jià)臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后。評(píng)價(jià)該方法的精密度、靈敏度、穩(wěn)定性、正常參考值范圍等指標(biāo)，并與與Dadebehring公司的同類試劑進(jìn)行了臨床血清

12、標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性比較。結(jié)果顯示：(1)進(jìn)口原裝反應(yīng)液和稀釋緩沖液與本實(shí)驗(yàn)室研制反應(yīng)液和稀釋液同樣條件下對(duì)30份正常人標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比測(cè)定結(jié)果相關(guān)性好，r=0.991，P<0.01，線性方程為Y(自制試劑)=-0.11+1.012X(德靈試劑)，結(jié)果有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，37℃條件下一年內(nèi)保存均穩(wěn)定有效。(2)IgA、IgG、IgM研制試劑：最低檢測(cè)限分別為0.028 g·L-1、0.72 g·L-1、0.022g·L-1

13、；批內(nèi)精密度2.1％～4.9％、1.6％～3.5％、3.5％～5.0％，批間精密度2.0％～3.1％、3.0％～4.5％、2.6％～4.1％；IgA樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達(dá)到10 g·L-1、600mg·L-1、9.9g·L-1時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性影響，IgG樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達(dá)到10g·L-1、600mg·L-1、19 g·L-1時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性影響，IgM樣本中

14、的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達(dá)到10g·L-1、600mg·L-1、4.6g·L-1時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性影響；測(cè)定54份臨床血清標(biāo)本計(jì)算與進(jìn)口同類試劑測(cè)得結(jié)果顯示兩種試劑相關(guān)性好，結(jié)果有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：IgA線性方程為Y(自制試劑)=1.101+0.881X(德靈試劑)，相關(guān)系數(shù)為0.980；IgG線性方程為Y(自制試劑)=0.148+0.901X(德靈試劑)，相關(guān)系數(shù)為0.979；IgM線性方程為Y(自制試劑)=1

15、.045-0.075X(德靈試劑)，相關(guān)系數(shù)為0.967。正常參考值范圍IgA、IgG、IgM分別為0.59～4.31g·L-1、6.9～17.92g·L-1、0.35～2.23g·L-1。(3)補(bǔ)體C3、C4研制試劑：最低檢測(cè)限分別為0.022g·L-1、0.0014 g·L-1；批內(nèi)精密度2.0％～4.9％、4.5％～5.0％，批間精密度5.4％～6.8％、3.8％～5.1％；C3樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分

16、別達(dá)到10 g·L-1、600mg·L-1、5.7g·L-1時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性影響，C4樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達(dá)到10 g·L-1、600mg·L-1、2.4g·L-1時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性影響；測(cè)定54份臨床血清標(biāo)本計(jì)算與進(jìn)口同類試劑側(cè)得結(jié)果顯示兩種試劑相關(guān)性好，結(jié)果有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：C3線性方程為Y(自制試劑)=-0.245+1.006X(德靈試劑)，相關(guān)系數(shù)為0.974；C4線性方程為Y(自制試劑)

17、=1.101+0.993X(德靈試劑)，相關(guān)系數(shù)為0.961。正常參考值范圍C3、C4分別為0.90～1.68g·L-1、0.110～0.408g·L-1。(4)穩(wěn)定性；將免疫球蛋白類免疫比濁抗體試劑和標(biāo)準(zhǔn)品于37℃放置7天后，標(biāo)準(zhǔn)品散射光Value值有所下降，但標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，檢測(cè)范圍無(wú)改變，3個(gè)陽(yáng)性血清的測(cè)值與放置前接近，批內(nèi)和批間精密度CV仍低于10％。我們的研究結(jié)果表明，建立的定時(shí)散射比濁分析法測(cè)定免疫球蛋白系統(tǒng)IgA、IgG、I