肽適體作用滯留核糖體拯救因子SmpB和ArfA的初步研究.pdf

1、維氏氣單胞菌是一種常見的水產(chǎn)致病菌，由其引起的細(xì)菌性病害，常常會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)不可估量的損失。因此，深入了解病原菌的遺傳機(jī)理及其致病機(jī)制，對(duì)開發(fā)新型的疾病防控手段具有指導(dǎo)意義。近年來(lái)研究表明，核糖體拯救對(duì)病原菌恢復(fù)或維持毒力至關(guān)重要。為此，本研究以核糖體拯救因子SmpB和ArfA為研究對(duì)象，尋找可與其相互作用的肽適體，同時(shí)作用于兩條主要的核糖體拯救途徑，并探究其對(duì)病原宿主菌的生理生化影響，為致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。所獲的主要研究結(jié)果如下

2、：
　　首先，合成了可編碼16個(gè)隨機(jī)氨基酸的寡核苷酸文庫(kù)。以此為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出雙鏈的文庫(kù)DNA，并以改造的葡萄球菌核酸酶SNase為腳手架蛋白，借助兩端限制性酶切位點(diǎn)，成功將文庫(kù)DNA片段插入至SNase中，獲得系列質(zhì)粒pTRG-SNP。轉(zhuǎn)化、篩選并隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)文庫(kù)保持多樣性，庫(kù)容量可達(dá)1.5×107以上，完全符合作為一個(gè)隨機(jī)文庫(kù)參與肽適體的篩選。
　　繼而，以維氏氣單胞菌基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)引物克

3、隆了核糖體拯救因子smpB基因和arfA基因，以誘餌載體pBT為原始質(zhì)粒，構(gòu)建了誘餌重組質(zhì)粒pBT-smpB和pBT-arfA。分析可知，基因smpB的開放式閱讀框（ORF）含有489bp堿基對(duì)，編碼一個(gè)含162個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)其分子量大約為18.6kDa,pI為9.86，三維結(jié)構(gòu)模擬顯示，含有3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊，均與其他β或γ變形菌門該蛋白具有高度的同源性?；騛rfA ORF含有240bp，編碼一條大小為79個(gè)氨基酸多肽，預(yù)

4、測(cè)其分子量大小約為9.14， pI為10.25，這與其他一些菌屬的ArfA蛋白也具有較好的同源性。
　　其次，通過(guò)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)腳手架蛋白SNase可以與SmpB蛋白相互作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，ArfA蛋白不與SNase相互作用，但能專一性與不同氨基酸組成的16肽相互作用，從而成功的從肽適體文庫(kù)中“釣取”了12條特異性的肽適體。由此提示，這些肽適體可能作用于ArfA的不同區(qū)域或位點(diǎn)。
　　最后，為了分析這些蛋白體內(nèi)表達(dá)對(duì)宿主

5、菌的生長(zhǎng)影響，借助穿梭質(zhì)粒pRE112,成功將可表達(dá)SNase和SNP的質(zhì)粒pN-SN和pN-SNP轉(zhuǎn)化至維氏氣單胞菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25或30℃時(shí)，SNP的表達(dá)，宿主菌表現(xiàn)為生長(zhǎng)減緩；42℃時(shí)，SNase或SNP的表達(dá)，表現(xiàn)為有助于菌體的生長(zhǎng)。使用2.0％(w/v)KCl或10%(w/v)葡萄糖，或卡那霉素、四環(huán)素處理時(shí)，表達(dá)有SNP的維氏氣單胞菌生長(zhǎng)更加緩慢；而表達(dá)有SNase的菌株相較于空載pRE112組，對(duì)2.0%(w/v)KC