昆仙膠囊對MRL-lpr小鼠狼瘡性腎炎代謝組學(xué)影響的研究.pdf

1、目的與意義:狼瘡性腎炎(Lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)累及腎臟所引起的一種免疫復(fù)合物腎炎,臨床上以發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、皮疹及腎臟損害癥狀為主要表現(xiàn)。約有40％～75％的SLE患者在患病5年內(nèi)出現(xiàn)臨床腎臟受累表現(xiàn),而腎活檢幾乎100％有腎臟病理改變。LN是SLE患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥,也是最常見的死亡原因之一,對其進(jìn)行積極治療和有效地控制病情進(jìn)展,至關(guān)重要。
　　 到目前為止,有關(guān)LN的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完

2、全清楚,但其主要的發(fā)病過程已得到深入研究:高度活化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體,與自身抗原形成免疫復(fù)合物是致病的主要因素,相應(yīng)的細(xì)胞因子在發(fā)病過程中起輔助作用。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡異常,產(chǎn)生核小體,暴露自身隱蔽抗原,可能是發(fā)病的主要始動(dòng)環(huán)節(jié)。另外,樹突狀細(xì)胞也參與了LN的發(fā)病和發(fā)展。
　　 LN治療的最終目標(biāo)是防止疾病的復(fù)發(fā),保護(hù)腎功能,盡可能減少并發(fā)癥,促進(jìn)患者的康復(fù)。對LN的早期診斷、早期藥物治療是緩解癥狀和控制疾病

3、進(jìn)程的關(guān)鍵?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,LN的治療原則應(yīng)包括免疫抑制治療和支持治療,免疫抑制治療的強(qiáng)度應(yīng)根據(jù)臨床表現(xiàn)、血清學(xué)檢查結(jié)果及腎臟病變的組織學(xué)活性確定。支持治療包括嚴(yán)格控制高血壓和高脂血癥,及其他防治慢性腎臟病(CKD)的治療手段。雖然西藥能在一定程度上控制疾病的活動(dòng)和發(fā)展,但許多藥物不良反應(yīng)明顯,停藥后病情易復(fù)發(fā),且價(jià)格昂貴,為此我們有必要結(jié)合中醫(yī)藥治療LN。
　　 中醫(yī)無系統(tǒng)性紅斑狼瘡病名,但其臨床表現(xiàn)在文獻(xiàn)中有類似描述,如“蝴蝶

4、斑”、“陰陽毒”、“日曬瘡”等,而狼瘡性腎炎則見于“水腫”、“虛損”等病證中。目前,不少醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)理論對LN的病因、病機(jī)、辨證論治等方面進(jìn)行了長期而廣泛深入的討論,形成了較完善的理論體系。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,LN起于先天稟賦不足、肝腎陰虛,在情志內(nèi)傷、勞倦過度、六淫侵襲、陽光暴曬等誘發(fā)因素的作用下,導(dǎo)致熱毒內(nèi)盛或瘀血阻絡(luò),內(nèi)侵臟腑而成。在LN病情發(fā)展過程中,無論活動(dòng)期、緩解期和恢復(fù)期,中醫(yī)辨證“腎虛”始終存在。故治療應(yīng)以補(bǔ)腎固本貫穿始終。在

5、臨床治療上,發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點(diǎn)治療疾病的優(yōu)勢,可以提高本病的整體療效。因此,如何利用傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特長,對這一難治性疾病進(jìn)行有效的治療,是研究LN的重要課題之一。
　　 代謝組學(xué)是一門在新陳代謝的動(dòng)態(tài)進(jìn)程中,系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)的科學(xué)。應(yīng)用核磁共振(NMR)、液相色譜.質(zhì)譜(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)等高通量、高分辨、高靈敏度的現(xiàn)代儀器分析手段,獲得體液中代謝產(chǎn)物的信息。通過代謝組學(xué)方

6、法,研究生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物(主要是低分子量代謝物)在疾病或外源性物質(zhì)等因素?cái)_動(dòng)下的動(dòng)態(tài)變化,可以反映生物體的病理生理變化趨勢,進(jìn)而揭示其變化的機(jī)制。因此,代謝組學(xué)對研究疾病的發(fā)病、診斷、藥物治療有著直接意義。
　　 昆仙膠囊是由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟絲子組成,具有溫陽益腎,活血祛風(fēng)除濕等功效。其主要成分昆明山海棠(THH)是衛(wèi)矛科雷公藤屬藥物,與中藥雷公藤含有多種相同的活性成分,具有抗炎和免疫抑制作用。近20年來,TH

7、H被廣泛應(yīng)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、纖維組織炎、紅斑狼瘡、慢性腎炎等多種結(jié)締組織病及自身免疫性疾病。昆仙膠囊作為一種新型免疫抑制劑,對慢性腎臟病引起的蛋白尿均有較好的療效,并且治療期間無嚴(yán)重的肝、腎功能損害或白細(xì)胞降低等情況,服用較安全,已在臨床上廣泛應(yīng)用于狼瘡性腎炎的治療。目前,盡管對昆仙膠囊已經(jīng)有大量的臨床療效報(bào)道,但是實(shí)驗(yàn)研究相對滯后。所以,應(yīng)該加強(qiáng)對昆仙膠囊作用機(jī)理的研究,為有效利用其藥效作用和防治、拮抗不良反應(yīng)做好基礎(chǔ)。
　

8、　 MRL/lpr小鼠是一種先天性免疫缺陷小鼠,是常用的SLE動(dòng)物模型之一。MRL/lpr小鼠的癥狀與人類紅斑狼瘡相似,包括顯著的血清自身抗體,免疫復(fù)合物腎小球腎炎,血管炎等。通過對其研究闡明了人類LN發(fā)病機(jī)制中的很多問題,對當(dāng)前發(fā)展新的診療方法有重要意義。
　　 為了驗(yàn)證昆仙膠囊對LN的治療作用,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),本實(shí)驗(yàn)采用MRL/lpr小鼠狼瘡腎炎模型,觀察昆仙膠囊對狼瘡腎炎小鼠血清抗體,蛋白尿,免疫器官的影響及小鼠

9、血清的代謝表型改變,并對其作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。
　　 方法和內(nèi)容
　　 2.1.研究對象將18只12～14周齡MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為三組:模型對照組6只；昆仙膠囊組6只；來氟米特組6只。分別給予生理鹽水；昆仙膠囊0.234mg/g/d；來氟米特片0.0026mg/g.d。各組小鼠每天固定時(shí)間灌胃,連續(xù)給藥4周。
　　 2.2.一般情況每周記錄小鼠體重并觀察各組小鼠精神狀態(tài)、食量、活動(dòng)、關(guān)節(jié)、毛色等一般情況。

10、
　　 2.3.尿蛋白及血清抗體檢測給藥前后測尿蛋白濃度及血清ANA、抗dsDNA抗體的含量。
　　 2.4.小鼠免疫器官重量測定末次給藥24h后稱體重,放血處死小鼠,摘胸腺、脾臟、稱其濕重,分別計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(mg/10g)。脾(胸腺)指數(shù)=10×脾(胸腺)重(mg)/體重(g)。
　　 2.5.病理組織檢查小鼠雙腎置于4％中性甲醛溶液中固定,石蠟包埋、切片,作HE染色,進(jìn)行光鏡檢查。
　　 2.

11、6.代謝組學(xué)研究用基于1H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)方法檢測用藥后各組小鼠血清,觀察昆仙膠囊對小鼠血清中代謝產(chǎn)物的影響,并對相應(yīng)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 2.7.數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0、MestReNova5.3.1及SIMCA-P12.0.1軟件包對數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果
　　 3.1.各組小鼠的一般情況實(shí)驗(yàn)開始前,各組小鼠均毛色光滑,飲食、活動(dòng)、體重?zé)o差別。在實(shí)驗(yàn)過程中,模型對照組小鼠逐漸出現(xiàn)食

12、欲減退,生長緩慢,活動(dòng)減少,精神萎靡,反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)。
　　 3.2.尿蛋白及血清抗體檢測
　　 3.2.1.尿蛋白檢測給藥前,三組小鼠尿蛋白濃度無顯著性差異(P>0.05)。給藥4周末,昆仙膠囊組和來氟米特組小鼠尿蛋白濃度與模型對照組比較明顯降低(P<0.05,P<0.01)；并且兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。比較各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后尿蛋白濃度發(fā)現(xiàn),兩個(gè)治療組小鼠給藥后比給藥前尿蛋白濃度均降低(P<0.05,P<

13、0.05)；而模型對照組實(shí)驗(yàn)前后比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 3.2.2.血清抗體檢測三組小鼠給藥前,血清ANA水平及抗dsDNA抗體水平均無顯著性差異(P>0.05)。給藥后,兩個(gè)用藥組與模型對照組比較,血清抗體水平均明顯降低,差異具有顯著性(P<0.01,P<0.01)。與給藥前比,模型對照組ANA水平在給藥4周末無明顯變化(P>0.05),而抗dsDNA抗體水平顯著升高(P<0.01)；昆仙膠囊組與來氟米特組給

14、藥后血清ANA水平均明顯降低,差異具有顯著性(P<0.01,P<0.01),抗dsDNA抗體水平雖比給藥前有所升高,但是顯著低于同時(shí)間模型對照組抗體水平(P<0.05)。
　　 3.3.免疫器官重量測定結(jié)果昆仙膠囊組胸腺指數(shù)明顯升高,與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但脾指數(shù)與模型對照組相比無顯著差異。來氟米特組脾指數(shù)明顯上調(diào)(P<0.05)。
　　 3.4.腎臟病理學(xué)檢查光鏡下觀察到模型對照組小鼠腎小球

15、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞呈輕中度增生,而兩個(gè)給藥組小鼠腎臟病變均較模型對照組有所減輕(P<0.01)。
　　 3.5.代謝組學(xué)改變兩個(gè)給藥組跟模型對照組比較發(fā)現(xiàn),支鏈氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、酮體、檸檬酸、肌酸、磷酸膽堿、?；撬帷⑵咸烟堑却x組分發(fā)生改變。
　　 結(jié)論
　　 4.1.通過觀察昆仙膠囊對LN模型小鼠免疫學(xué)指標(biāo)及腎臟病理改變的影響,發(fā)現(xiàn)昆仙膠囊可以顯著降低自身抗體及尿蛋白水平；并能調(diào)節(jié)免疫器官,控制腎臟病理損

16、害的進(jìn)展。提示昆仙膠囊能夠控制LN的活動(dòng),緩解病情。
　　 4.2.用基于1H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)方法檢測用藥后各組小鼠血清,研究結(jié)果顯示,昆仙膠囊組小鼠血清跟模型對照組比較,支鏈氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、檸檬酸、磷酸膽堿、?；撬?、葡萄糖含量升高；而酮體、肌酸等代謝組分含量則低于模型對照組。推測昆仙膠囊發(fā)揮作用的機(jī)制包含以下幾個(gè)方面:一、促進(jìn)機(jī)體正常能量代謝以及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、免疫力；二、穩(wěn)定細(xì)胞膜,維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡；