促甲狀腺激素通過PKA通路抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪甘油三酯脂酶的表達(dá).pdf

1、目的:
　　1、脂肪細(xì)胞已經(jīng)被證明可以表達(dá)功能性TSHR，本課題擬觀察Tshr-/-小鼠附睪脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá);另外在體外實(shí)驗(yàn)中用TSH處理誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞，觀察TSH對ATGL表達(dá)的影響，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)來探討TSH在脂解過程中可能發(fā)揮的作用，揭示亞臨床甲減致肥胖的可能分子機(jī)制。
　　2、利用cAMP激動劑forskolin和PKA抑制劑H89及TSH分別處理誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞，觀察細(xì)胞中ATGL的表

2、達(dá)，以此來觀察cAMP/PKA通路是否參與了TSH對ATGL的作用、揭示其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):按照培養(yǎng)方案將3T3-L1小鼠成纖維細(xì)胞通過誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)成為成熟的脂肪細(xì)胞，在將細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化的過程中，分別觀察不同天數(shù)時細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。并用0.1μM、1μM、2μ M的bTSH分別處理分化成熟的脂肪細(xì)胞24小時及48小時，然后觀察細(xì)胞中ATGL表達(dá)的變化。
　　2、動物模型:Tshr-

3、/小鼠及Tshr+/+小鼠飼養(yǎng)于屏障(SPF)環(huán)境中，按照白天與夜晚各12小時予以晝夜循環(huán)，飼料和水自由攝入。4-6周斷乳后對雄性小鼠進(jìn)行基因型鑒定，按照基因型鑒定結(jié)果將同窩雄性小鼠分為三組:Tshr+/+、Tshr+/-和Tshr-/-，Tshr-/-組小鼠予以外源性補(bǔ)充T4; Tshr-/小鼠和Tshr+/+小鼠用于實(shí)驗(yàn)。
　　3、利用油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的情況。
　　4、采用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中ATGL基

4、因mRNA的表達(dá)。
　　5、采用Western Blotting方法檢測細(xì)胞中ATGL蛋白的表達(dá)。
　　6、采用免疫熒光方法觀察ATGL在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)和分布。
　　7、采用免疫組化方法觀察ATGL在脂肪組織細(xì)胞中的表達(dá)及分布。
　　8、采用SAS系統(tǒng)和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用(x)±s做描述，多組均數(shù)比較采用方差分析，方差不齊的采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。
　　結(jié)

5、果:
　　1、小鼠Tshr基因敲除后附睪周圍脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的表達(dá)明顯增加
　　我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)，觀察了Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的分布和表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示:在小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中，脂肪細(xì)胞中的脂滴呈空泡狀，細(xì)胞核被脂滴擠到一邊，緊貼細(xì)胞膜，ATGL呈棕黃色，分布于細(xì)胞質(zhì)中，亦被脂滴擠到一邊、緊貼細(xì)胞膜;與Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠脂

6、肪組織石蠟切片中，脂肪細(xì)胞中ATGL表達(dá)增多。同時，我們用Western blotting方法和RT-PCR方法分貝檢測了附睪脂肪組織中ATGL蛋白的表達(dá)和mRNA的表達(dá)。與Tshr+/+小鼠相比，Tshr-/-小鼠附睪脂肪細(xì)胞中ATGL的蛋白表達(dá)及RNA表達(dá)都明顯增加，這些都提示TSH可能抑制脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。
　　2、TSH抑制成熟3T3-L1細(xì)胞中ATGL的表達(dá)
　　2.1 在3T3-L1細(xì)胞被誘導(dǎo)分化的過程中

7、，細(xì)胞中的ATGL的蛋白表達(dá)逐漸增加。
　　在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中，ATGL的蛋白表達(dá)量很少，隨著誘導(dǎo)分化過程中天數(shù)的增加，細(xì)胞中ATGL的蛋白量逐漸增加，至D16天，80％-90％的前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，ATGL的蛋白表達(dá)量最高。
　　2.2 TSH抑制成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)
　　我們分別用0.1μM、1μM、2μM bTSH處理成熟脂肪細(xì)胞24小時和48小時，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，b

8、TSH刺激后成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL表達(dá)明顯減少:處理24小時后，0.1μM、1μM與2μ M bTSH處理組與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量分別減少了31.1％(p＜0.01)、57.3％(p＜0.01)和58.1％(p＜0.01);處理48小時后，0.1μM、1μM與2μM bTSH處理組與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量分別減少了45.1％(p＜0.01)、60.5％(p＜0.01)和77.1％(p＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。bTSH對ATGL的這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性，尤其在細(xì)胞被bTSH處理48小時后，不同劑量組間的差異顯著（皆p＜0.01）。但bTSH對ATGL的抑制作用在0.1μM和1μM時并沒有表現(xiàn)出顯著的時間依賴性:0.1μMbTSH分別處理細(xì)胞24小時和48小時后，細(xì)胞內(nèi)的ATGL的蛋白表達(dá)均減少，但兩組ATGL減少的量之間的差異并不顯著;同樣，應(yīng)用1μM bTSH分別處理細(xì)胞24小時和48小時后，兩組細(xì)胞內(nèi)的ATGL的蛋白表達(dá)均減

10、少，但兩組ATGL減少的量之間的差異也并不顯著。但是應(yīng)用2μ M bTSH分別處理細(xì)胞48小時后，細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白表達(dá)的減少較處理24小時后ATGL表達(dá)的減少更顯著(p＜0.01)。
　　用2μM bTSH處理成熟脂肪細(xì)胞48小時后，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)觀察細(xì)胞中ATGL的mRNA含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中ATGL的mRNA的含量較空白對照組減少約70％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　以上結(jié)果顯示，bTSH可以抑

11、制成熟脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)，這種作用呈劑量依賴性。
　　3、TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制ATGL的表達(dá)
　　3.1 cAMP激動劑forskolin可以抑制成熟3T3-L1細(xì)胞中ATGL的表達(dá)
　　3T3-L1細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，分別用濃度為2.5uM和5uM的forskolin處理細(xì)胞24小時后，應(yīng)用Western blotting方法檢測細(xì)胞中ATGL的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，2

12、.5uM處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量減少了47％(p＜0.01)，5uM處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL蛋白含量減少了52％(p＜0.01)。
　　3.2 PKA抑制劑H89對于成熟3T3-L1細(xì)胞中ATGL的表達(dá)無明顯影響
　　將3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，分別用濃度為5uM和10uM的H89處理細(xì)胞24小時后，應(yīng)用Western blotting方法檢測細(xì)胞中ATGL的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，兩個處理組細(xì)胞內(nèi)

13、ATGL蛋白的含量幾乎無變化(p＞0.05)。
　　3.3 TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的表達(dá)
　　將3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先用10uM的H89預(yù)處理細(xì)胞1小時，然后加入2uM的bTSH;其它幾皿的細(xì)胞，則分別單獨(dú)加入2uM的bTSH、5uM的forskolin和10uM的H89，另外一皿細(xì)胞則作為空白對照組。細(xì)胞被處理24小時后，應(yīng)用Western blott

14、ing方法和免疫熒光方法檢測細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示:與對照組相比，bTSH處理細(xì)胞組及forskolin處理細(xì)胞組細(xì)胞內(nèi)ATGL的表達(dá)均明顯受到抑制(p＜0.01，p＜0.01); H89處理細(xì)胞組，脂肪細(xì)胞內(nèi)ATGL的蛋白含量無明顯變化;同樣，用H89預(yù)處理后再用bTSH處理的細(xì)胞組，細(xì)胞內(nèi)ATGL的蛋白含量較對照組也沒有明顯變化。免疫熒光結(jié)果與Western blotting結(jié)果一致，免疫熒光

15、結(jié)果顯示:ATGL表現(xiàn)為紅色熒光，位于成熟脂肪細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，與對照組相比，bTSH及forskolin處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL的熒光亮度明顯減弱，H89處理組ATGL的熒光亮度較對照組相比無明顯變化，同樣，用H89預(yù)處理后再用bTSH處理的細(xì)胞組，細(xì)胞內(nèi)ATGL的熒光亮度較對照組也沒有顯著變化。
　　綜合上述結(jié)果說明，forskolin可以增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量、激活PKA，從而可以抑制ATGL的表達(dá);而當(dāng)先利用H89將PKA的活性

16、抑制后，再用TSH處理細(xì)胞，TSH與TSHR結(jié)合后無法活化PKA，從而無法發(fā)揮TSH對ATGL的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1、TSH對脂肪細(xì)胞中甘油三酯的分解代謝具有調(diào)節(jié)作用。
　　2、TSH可以抑制小鼠成熟脂肪細(xì)胞中ATGL的表達(dá)。
　　3、TSH通過激活cAMP/PKA通路來發(fā)揮抑制ATGL表達(dá)的作用。
　　意義:
　　亞臨床甲減的患病人數(shù)逐漸增加，它與許多疾病相關(guān)，但對其的診斷和治療都缺乏有力