虎乳靈芝多糖的多級結(jié)構(gòu)及溶液行為研究.pdf

1、虎乳靈芝（Lignosus rhinocerotis）是一種食藥兩用真菌，具有很高的營養(yǎng)價值和廣泛的生物活性，多糖是其中主要活性成分之一。并且，多糖的功能特性（營養(yǎng)、工藝或生物活性）與它們的多級結(jié)構(gòu)（單糖組成、糖苷鍵、支化度、分支長度、分子量和鏈構(gòu)象）及溶液行為密切相關(guān)。因此，本論文從虎乳靈芝菌核中提取得到高支化多糖(LRP)，對其多級結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子尺寸和鏈構(gòu)象）及溶液行為進行了研究，以期為闡明LRP的精細結(jié)構(gòu)、加工特性及構(gòu)效關(guān)系

2、提供理論依據(jù)，也為高支化多糖在食品行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　本論文主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下。采用不同溫度的水提法（25℃、95℃和120℃）和1 mol/L的NaOH溶液(4℃)從虎乳靈芝菌核中成功得到四種多糖級分(LRP-1、LRP-2、LRP-3和LRP-4)，用尺寸排除色譜-多角度激光光散射儀-示差檢測儀（SEC-MALLS-RI）、氣相色譜儀(GC)、傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)及紫外可見分光光度計(UV-vis)

3、分析了四種LRP級分的結(jié)構(gòu)、分子尺寸和鏈構(gòu)象，并用環(huán)磷酰胺(Cy)誘導(dǎo)的免疫低下模型評價了它們的免疫調(diào)節(jié)活性。LRP-1和LRP-2是多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物（46～68％β-D-葡聚糖和27～48％蛋白質(zhì)），而LRP-3和LRP-4完全由D-葡萄糖組成。相比于LRP-1、LRP-2和LRP-3，LRP-4具有低分散性、高分子量(Mw，5.86×106 g/mol)和高粘度（[η]，202.6 mL/g）?；冢糞2＞z1/2-Mw的指數(shù)β及

4、其“U型”分布曲線，可以得出四種LRP級分皆是一種高支化的大分子，其中LRP-3比LRP-2在水中具有更為緊縮的球形構(gòu)象。此外，四種LRP級分通過提高免疫器官指數(shù)、促進淋巴細胞增殖和刺激重要細胞因子TNF-α和INF-γ的分泌來提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的免疫力。
　　采用第二章的提取方法（將NaOH溶液濃度降低至0.5 mol/L）從虎乳靈芝菌核中得到堿溶性多糖(LRP)，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、FT-IR、

5、GC、1D和2D核磁共振儀(NMR)等儀器結(jié)合單糖組成分析、高碘酸氧化、Smith降解（包括可控Smith降解）和甲基化分析表征了LRP的結(jié)構(gòu)特征。LRP是以(1→3)-β-D-Glcp為主鏈，每3個葡萄糖殘基帶有1個(1→6)-鏈接的高支化側(cè)鏈，該支鏈由3個(1→6)-β-D-Glcp殘基構(gòu)成次級主鏈，且含有2個在O3位取代的β-D-Glcp端基。LRP的支化度為0.76，表明其具有高度支化的結(jié)構(gòu)。采用SEC-MALLS-Vis-RI

6、檢測得到LRP在25℃下0.25M LiCl/DMSO溶液中的Mw、＜S2＞z1/2、流體力學(xué)半徑(Rh)和[η]值分別為2.88×105 g/mol、30.36 nm、22.34 nm和131.5 mL/g。此外，[η]-Mw的指數(shù)α、＜S2＞z1/2-M的指數(shù)β、分形維數(shù)df及分子參數(shù)ρ分別為0.20、0.33、2.50和1.36，證明LRP是一種高支化多糖且在LiCl/DMSO溶液中呈現(xiàn)緊縮線團構(gòu)象。
　　采用SEC-MAL

7、LS-Vis-RI、馬爾文納米粒度儀(DLS)、FT-IR、UV-vis、圓二色譜儀(CD)、透射電鏡(TEM)等儀器并結(jié)合剛果紅實驗分析了超聲處理不同時間對LRP稀溶液（1 mg/mL）的有序結(jié)構(gòu)、分子參數(shù)及鏈構(gòu)象的影響，揭示了超聲波作用下LRP在水中的分散機制。剛果紅實驗和CD的結(jié)果表明，超聲處理0-90min，LRP的有序結(jié)構(gòu)仍然存在。短時間的超聲可提高LRP的水溶性，溶液由渾濁變澄清，LRP的各分子參數(shù)(Mw、Mn、＜S2＞z1

8、/2、[η]和Rh)急劇下降，分子量分布變寬，粒度變小，而長時間的超聲會使溶液再次變渾濁，各分子參數(shù)趨于平緩，甚至有上升趨勢，分子量分布變窄，粒度變大。結(jié)合構(gòu)象參數(shù)α（[η]-Mw的指數(shù)）和β（＜S2＞z1/2-Mw的指數(shù)），發(fā)現(xiàn)超聲處理后LRP的緊湊線團先變松散再變緊密。綜上，超聲波作用下LRP在水中的分散機制如下:超聲前期，LRP溶液中較大的聚集體在空化效應(yīng)的作用下被分散為一些小線團，溶解性增加，溶液由渾濁變澄清;隨超聲時間的延長，

9、LRP溶液中的小線團越來越多，由于過度密集和表面效應(yīng)發(fā)生聚集，使溶液又變渾濁。
　　運用流變學(xué)的方法研究了濃度對LRP的溶液行為的影響。穩(wěn)態(tài)剪切測試結(jié)果表明，LRP/水體系為剪切變稀的假塑性流體，剪切稀釋現(xiàn)象隨濃度增大而更加顯著?；贑ross模型和冪率定律擬合，LRP/水體系從稀溶液到濃溶液的臨界轉(zhuǎn)變濃度（也稱交疊濃度，c*）為2.65 mg/mL，與通過特性粘數(shù)（[η]，378±32mL/g）的倒數(shù)計算得到的c*值相一致。動態(tài)

10、頻率掃描和微流變測試顯示，LRP/水體系的儲能模量(G')與損耗模量(G")隨角頻率(ω)的增大而增大，且在濃度約為10mg/mL，體系由濃溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槿跄z。LRP/水體系的彈性和粘度隨濃度的增大而增加，且流動性變差。當(dāng)LRP/水體系濃度≤12.5 mg/mL時，其更偏向于粘性液體;而當(dāng)濃度為15和20 mg/mL時，其更偏向于彈性固體。當(dāng)LRP/水體系濃度為8、9和10 mg/mL時，動態(tài)復(fù)合粘度（η*）和穩(wěn)態(tài)剪切粘度（η）的關(guān)系符合

11、Cox-Merz準則，濃度過高或過低，都會偏離Cox-Merz準則，表明過高或過低的濃度會導(dǎo)致LRP分子在動態(tài)振蕩和穩(wěn)態(tài)剪切不同的運動模式下發(fā)生了不同程度的分子重排。蠕變-恢復(fù)測試顯示，不同濃度的LRP/水體系的蠕變段采用Burgers模型擬合得到的瞬時彈性柔量（J0）、延遲彈性柔量（J1）、最大柔量（Jmax）和延遲時間(λ)隨濃度的增加而降低，零剪切粘度(η0)隨濃度的增加而上升，柔量恢復(fù)百分比（R）隨濃度的增加從58.51％增大到

12、92.30％，表明體系彈性增強。觸變環(huán)的面積隨濃度的增加而變大，表明濃度對LRP/水體系的觸變性影響較大且呈正相關(guān)。LRP/水體系的穩(wěn)定性隨濃度的增大而增加，當(dāng)濃度≥7 mg/mL時，不再發(fā)生聚集沉淀的現(xiàn)象。
　　運用流變學(xué)的方法研究了LRP凝膠的自修復(fù)性能及溫度對其溶液行為的影響。應(yīng)變(γ)和頻率(ω)對LRP體系(15 mg/mL)造成的影響是可逆的，被破壞的纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能快速地自行修復(fù)。并且，LRP/水體系在較大的γ(100

13、％)下由凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎沉鲬B(tài)，一旦這個較大的γ被移除后，LRP/水體系又能從粘流態(tài)恢復(fù)至凝膠態(tài)，表明LRP凝膠具有自修復(fù)能力。LRP體系在整個升溫和降溫的過程中一直處于凝膠態(tài)，且溫度對LRP凝膠的影響是不可逆的。第一次升溫過程中，LRP存在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg，49.35℃)，暗示LRP發(fā)生了變性，從有序向無序轉(zhuǎn)變;降溫過程體系的粘彈性有所恢復(fù)。在第二次升溫過程中，G和G"曲線中的玻璃化轉(zhuǎn)變峰消失，表明已變性的LRP不能恢復(fù)至最初的狀態(tài)，

14、且變性后的LRP凝膠仍具有熱不穩(wěn)定性。經(jīng)過第一次升溫和降溫后，LRP凝膠的強度增大，但在經(jīng)歷第二次升溫和降溫后，其強度減弱。微流變測試發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)LRP/水體系濃度≥9mg/mL時，才能在一定溫度下形成凝膠，而當(dāng)濃度足夠大（≥20 mg/mL）時，其在常溫下就已經(jīng)形成凝膠。運用Arrhenius方程擬合表觀粘度（η）與溫度的關(guān)系計算出流動活化能（Ea），發(fā)現(xiàn)在剪切速率(·γ)恒定時，隨濃度的增大，LRP/水體系的Ea減小，表明LRP/水

15、體系流動性受溫度影響越不顯著。
　　采用流變儀研究了超聲對LRP濃溶液（15 mg/mL）的溶液行為的影響。超聲處理前后的LRP/水體系均呈現(xiàn)剪切變稀的假塑性流體特征，隨超聲時間的延長，LRP/水體系先增稠再變稀。超聲處理后的LRP/水體系均呈現(xiàn)與未超聲處理相同的弱凝膠性質(zhì)，隨超聲時間延長到10min，LRP凝膠的強度增加到最大值，隨后強度減弱。超聲處理后的LRP凝膠會更加偏離Cox-Merz準則。超聲處理前后的LRP/水體系在升