鐵負(fù)荷過低及visfatin對EMMPRIN表達(dá)的作用及機(jī)理探討.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦侨祟惤】档闹匾{，現(xiàn)有的治療手段主要側(cè)重于早期控制引發(fā)冠心病的危險(xiǎn)因素和晚期消除較大粥樣斑塊對血流動(dòng)力學(xué)的影響。然而，如何延緩斑塊的進(jìn)展，并使斑塊趨于穩(wěn)定依然是棘手的問題。
　　 在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展中，炎癥因子對斑塊的穩(wěn)定性意義重大。參與影響斑塊穩(wěn)定的炎癥因子有很多，如MMPs、IL1-β、TNF-α、IL-6等。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN）作為近年來發(fā)現(xiàn)的一

2、種炎癥因子，現(xiàn)被證實(shí)在影響斑塊穩(wěn)定性方面起了極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN在AS病變不穩(wěn)定斑塊處高表達(dá)。AS斑塊處，EMMPRIN同MMPs共定位。細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN不僅能控制巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞MMPs的表達(dá)，還能調(diào)節(jié)MMPs的活性。因此，研究體內(nèi)外各種因素對以EMMPRIN為中心的炎癥因子表達(dá)的影響，可以為臨床治療AS疾病提供新的思路和策略。
　　 鐵是人體重要的營養(yǎng)成分，同時(shí)鐵與心血管事件的發(fā)生關(guān)系密

3、切。曾有學(xué)說提出降鐵治療能減少心血管事件的發(fā)生率，但此學(xué)說迄今仍有爭議。目前對鐵與心血管事件的研究集中于鐵負(fù)荷過高所引起的自由基產(chǎn)生、氧化低密度脂蛋白生成、以及內(nèi)皮功能受損。但對降鐵治療效果不好的原因尚未明確，有關(guān)鐵負(fù)荷過低和炎癥反應(yīng)關(guān)系的研究很少。明確鐵負(fù)荷過低對以EMMPRIN為中心的炎癥因子表達(dá)的關(guān)系及其機(jī)理，可為臨床治療AS及解決關(guān)于降鐵治療的爭論提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 內(nèi)臟脂肪素(visfatin)是近期新發(fā)現(xiàn)

4、的一種脂肪細(xì)胞分泌因子，具有調(diào)節(jié)糖代謝、影響內(nèi)皮功能、調(diào)控微循環(huán)形成的功能。但visfatin調(diào)控炎癥因子的報(bào)道很少。有報(bào)道指出visfatin促進(jìn)單核細(xì)胞MMP-9表達(dá)。巨噬細(xì)胞作為AS斑塊處炎癥因子的主要來源，visfatin對巨噬細(xì)胞EMMPRIN等炎癥因子的調(diào)控情況并不清楚。明確visfatin對巨噬細(xì)胞EMMPRIN及其控制的下游炎癥因子的作用及其機(jī)理作用將對動(dòng)脈粥樣硬化的防治帶來新的思路。
　　 本研究擬通過下述四部

5、分實(shí)驗(yàn)探討鐵負(fù)荷過低和visfatin對巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞EMMPRIN及其下游炎癥因子表達(dá)的影響及其機(jī)理。為尋找通過干擾炎癥途徑，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 第一部分
　　 鐵負(fù)荷過低對巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)的影響
　　 目的：觀察鐵負(fù)荷過低對巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)、MMP-9表達(dá)及活性的影響。
　　 方法：體外誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為

6、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞，加入不同濃度鐵離子螯合劑去鐵胺，刺激12h或24h。應(yīng)用RT-PCR和Westernblot測定巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞中EMMPRIN基因和蛋白表達(dá)。Western blot測MMP-9蛋白表達(dá)，明膠酶譜法測MMP-9活性。
　　 結(jié)果：1．去鐵胺促進(jìn)巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN基因水平及蛋白水平表達(dá)。2．去鐵胺促進(jìn)MMP-9蛋白表達(dá)水平及活性。以上作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：鐵負(fù)荷過低增加巨噬

7、細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN及MMP-9的表達(dá)及活性，可能會促進(jìn)心血管事件的發(fā)生。
　　 第二部分
　　 鐵負(fù)荷過低促進(jìn)巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)的機(jī)理探討
　　 目的：探討鐵負(fù)荷過低上調(diào)巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)的機(jī)理。研究MAPK信號通路、視黃醛x受體(RXR)及過氧化物酶體增殖劑活化受體γ(PPARγ)在此過程中的作用。
　　 方法：1．為明確MAPK信號通路在DFO上調(diào)巨噬細(xì)胞

8、、泡沫細(xì)胞EMMPRIN中作用，巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞予以MAPK(p38，ERK1/2)信號通路抑制劑預(yù)處理1h后，加入或不加入去鐵胺繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細(xì)胞中EMMPRIN蛋白表達(dá)。巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞加入鐵離子鰲合劑去鐵胺刺激，Western blot檢測MAPK(p38，ERK1/2)磷酸化水平。2．為明確視黃醛x受體(RXR)天然配體對DFO上調(diào)巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN中作用，巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞予以黃

9、醛x受體(RXR)天然配體9-cis預(yù)處理1h后，加入或不加入去鐵胺繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細(xì)胞中EMMPRIN蛋白表達(dá)。3．為明確DFO是否通過下調(diào)PPARγ表達(dá)而促進(jìn)EMMPRIN表達(dá)，細(xì)胞予以DFO刺激24h后，Western blot檢測PPARγ表達(dá)量。4．為明確DFO是否通過模擬低氧效應(yīng)促進(jìn)EMMPRIN表達(dá)，巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞經(jīng)1％低氧刺激24h，Western blot測定細(xì)胞中EMMPRIN蛋白表達(dá)

10、。
　　 結(jié)果：
　　 1．p38MAPK通路抑制劑及RXR配體在本身不影響EMMPRIN表達(dá)的同時(shí)，抑制去鐵胺對EMMPRIN表到的上調(diào)作用。ERK1/2MAPK通路抑制劑無此作用。
　　 2．去鐵胺促進(jìn)p38MAPK的磷酸化，但不影響PPARγ蛋白表達(dá)及ERK1/2MAPK的磷酸化。
　　 3．低氧不影響巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)。
　　 結(jié)論：1．p38MAPK參與鐵負(fù)荷過低上調(diào)巨

11、噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN的過程。2．RXR可能參與該過程。3．鐵負(fù)荷過低上調(diào)巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞EMMPRIN的過程不經(jīng)其低氧模擬效應(yīng)或下調(diào)PPARγ表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
　　 第三部分
　　 Visfatin對巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)的影響
　　 目的：觀察visfatin對巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)、MMP-9表達(dá)及活性的影響。
　　 方法：體外誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，加入不同濃度visf

12、atin，刺激12h或24h。應(yīng)用RT-PCR和Western blot測定巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞中EMMPRIN基因和蛋白表達(dá)。RT-PCR和Western blot測MMP-9蛋白表達(dá)，明膠酶譜法測MMP-9活性。
　　 結(jié)果：1．visfatin促進(jìn)巨噬細(xì)胞EMMPRIN、MMP-9基因水平及蛋白水平表達(dá)。2．Visfatin促進(jìn)MMP-9蛋白活性。以上作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：visfatin增加巨噬細(xì)胞EM

13、MPRIN、MMP-9的表達(dá)及活性，可能會加劇斑塊的不穩(wěn)定性。
　　 第四部分
　　 Visfatin促進(jìn)巨噬細(xì)胞EMMPRIN表達(dá)的機(jī)理探討
　　 目的：探討visfatin上調(diào)巨噬細(xì)胞EMMPRIN、MMP-9表達(dá)的機(jī)理。研究MAPK信號通路、視黃醛x受體(RXR)及過氧化物酶體增殖劑活化受體γ(PPARγ)在此過程中的作用。
　　 方法：1．為明確MAPK信號通路在visfatin上調(diào)巨噬細(xì)胞、泡沫

14、細(xì)胞EMMPRIN、MMP-9中作用，巨噬細(xì)胞予以MAPK(p38，ERK1/2、JNK)信號通路抑制劑預(yù)處理1h后，加入visfatin繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細(xì)胞中EMMPRIN、MMP-9蛋白表達(dá)。巨噬細(xì)胞加入visfatin刺激，Western blot檢測MAPK(p38、ERK1/2、JNK)磷酸化水平。2．為明確視黃醛x受體(RXR)天然配體對visfatin上調(diào)巨噬細(xì)胞EMMPRIN中作用，巨噬細(xì)胞予

15、以黃醛x受體(RXR)天然配體9順式維甲酸預(yù)處理1h后，加入visfatin繼續(xù)培養(yǎng)24h，Western blot測定細(xì)胞中EMMPRIN及MMP-9蛋白表達(dá)。3．為明確PPARγ在visfatin上調(diào)EMMPRIN表達(dá)中的作用，巨噬細(xì)胞予以PPARγ配體預(yù)處理1h后，加入visfatin繼續(xù)培養(yǎng)24h，Westernblot測定細(xì)胞中EMMPRIN及MMP-9蛋白表達(dá)。細(xì)胞加入visfatin刺激，Westernblot檢測PPAR

16、γ表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1．p38MAPK通路抑制劑抑制visfatin對EMMPRIN及MMP-9的上調(diào)作用：viafatin促進(jìn)p38MAPK及ERK1/2MAPK的磷酸化。
　　 2．RXR配體抑制visfatin對EMMPRIN及MMP-9上調(diào)作用。
　　 3．PPARγ配體不影響visfatin對EMMPRIN及MMP-9的上調(diào)作用。Visfatin不影響PPARγ蛋白表達(dá)。