羅漢果的遺傳毒性與胚胎發(fā)育毒性實驗研究.pdf

1、目的:探討傳統(tǒng)中藥羅漢果的遺傳毒性和胚胎發(fā)育毒性,為羅漢果的食用及藥用安全性提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.急性毒性試驗:最大耐受劑量法(Maximumtolerateddose,MTD)檢測羅漢果對昆明小鼠和SD大鼠的經(jīng)口急性毒性。
　　 2.遺傳毒性試驗:
　　 (1)雄性小鼠遺傳毒性檢測:①精子畸形試驗:雄性昆明小鼠40只,隨機分為5組,8只/組。高、中、低劑量組(羅漢果水煎液30g/kg、

2、15g/kg、7.5g/kg)和陰性對照組(蒸餾水,0.2mL/20g)灌胃相應(yīng)劑量受試物,陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP40mg/kg),各組小鼠均連續(xù)用藥5d,1次/日。于首次給藥后第35d處死,取附睪制精子涂片,染色后,計數(shù)精子畸形率。②小鼠骨髓微核試驗:昆明雄性小鼠40只,分組及用藥劑量同上。羅漢果高、中、低劑量組和陰性對照組連續(xù)灌胃5d,1次/日;陽性對照組于處死前1d腹腔注射環(huán)磷酰胺,1次/日,連續(xù)2d。于末次用藥2h后處

3、死各組小鼠,取后肢股骨,制骨髓涂片,染色后計數(shù)骨髓中嗜多染紅細(xì)胞微核率。
　　 (2)孕鼠及胚胎遺傳毒性檢測:
　　 小鼠孕鼠骨髓微核試驗和胚胎肝轉(zhuǎn)移微核試驗:昆明小鼠孕鼠40只,分為5組,8只/組:羅漢果高、中、低劑量組(30g/kg、15g/kg、7.5g/kg)和陰性對照組(NS,0.2mL/20g)自孕12d起連續(xù)灌胃5d,1次/日。陽性對照組自孕15d起腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP40mg/kg),1次/日,連續(xù)2d

4、。于孕16d末次用藥2h后處死各組小鼠,制骨髓和胚胎肝細(xì)胞涂片,染色后計數(shù)孕鼠骨髓和胎鼠肝臟中嗜多染紅細(xì)胞微核率。
　　 (3)單細(xì)胞凝膠電泳試驗(SCEG):昆明小鼠40只,雌雄各半,分組及用藥劑量同上。陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(CP40mg/kg·d)1次,高、中、低劑量組和陰性對照組連續(xù)灌胃4d,各組于末次用藥24h后處死,單細(xì)胞凝膠電泳試驗檢查胸腺淋巴細(xì)胞DNA損傷情況。
　　 3.胚胎發(fā)育毒性試驗:①致畸試驗

5、:SD孕鼠50只,分為5組,10只/組。陽性對照組于大鼠孕10d時用維甲酸100mg/kg灌胃一次;羅漢果高、中、低劑量組(羅漢果水煎液30g/kg、15g/kg、7.5g/kg)和陰性對照組(蒸餾水,2.0mL/200g)于孕6d～18d,分別灌胃相應(yīng)劑量受試物,1次/日。各組孕鼠均于孕18d灌胃2h后麻醉處死,取卵巢、胚胎,記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)。觀察胚胎外觀畸形發(fā)生情況,稱量每只活胎鼠體重并測量其身長、尾長。稱子宮重、卵巢重

6、、胎盤重,計數(shù)黃體數(shù)。胚胎總數(shù)的一半用阿利新藍(lán)和茜素紅雙染后觀察胚胎骨骼發(fā)育情況,其它胚胎做成干重標(biāo)本并稱干重。②免疫組化方法檢測胚胎鼠脊髓組織中bcl-2、bax蛋白的表達(dá);③TUNEL法:熒光標(biāo)記檢測胚胎鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.遺傳毒性試驗:①羅漢果水煎液灌胃昆明小鼠和SD大鼠的最大給藥量均達(dá)到120g/kg。②羅漢果水煎液30g/kg、15g/kg、7.5g/kg劑量組的小鼠胎肝微核率、孕

7、鼠骨髓微核率、雄性小鼠骨髓微核率、精子畸形率與陰性對照組相比,均無顯著性差異(P＞0.05);彗星圖像顯示:各劑量羅漢果水煎液沒有引起淋巴細(xì)胞的DNA電泳明顯遷移,頭部DNA100％、尾部DNA100％、尾長、尾矩、Olive矩等相關(guān)指標(biāo)與陰性對照組相比,均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2.胚胎發(fā)育毒性試驗:①羅漢果水煎液30g/kg、15g/kg、7.5g/kg劑量組孕鼠的孕期增重、植入胚胎總數(shù)、吸收胎率、死胎率、畸胎

8、率以及胚胎著床后丟失率與陰性對照組相比,均無顯著性差異。胎盤重、胎鼠體重、身長、尾長、胚胎干重與陰性對照組相比,均無顯著性差異。羅漢果水煎液各劑量組胚胎均無外觀畸形發(fā)生,枕骨發(fā)育評分、胸骨節(jié)數(shù)、胸骨節(jié)的骨化數(shù)、四肢長骨的骨化長度與陰性對照組相比,均沒有顯著性差異(P＞0.05)。②羅漢果水煎液30g/kg、15g/kg、7.5g/kg劑量組胚胎脊髓組織bcl-2,bax蛋白表達(dá)的平均灰度值與陰性對照組相比,都沒有顯著性差異。羅漢果水煎液

9、各劑量組胚胎脊髓組織細(xì)胞的凋亡指數(shù)與陰性對照組比較,無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.羅漢果水煎液對昆明小鼠的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量大于120g/kg體重,羅漢果水煎液對SD大鼠的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量大于120g/kg體重。屬無毒級。
　　 2.羅漢果水煎液各劑量組對成年小鼠與胎鼠均無遺傳毒性。
　　 3.羅漢果水煎液對SD孕鼠沒有毒性作用。
　　 4.羅漢果不影響骨骼的分化和骨化,對

10、大鼠胚胎沒有致畸作用,在器官水平上,羅漢果水煎液沒有發(fā)育毒性。
　　 5.羅漢果水煎液各劑量組對大鼠胚胎脊髓組織的bcl-2,bax蛋白表達(dá)以及脊髓組織內(nèi)凋亡的細(xì)胞數(shù)無影響,說明在細(xì)胞和分子水平,羅漢果沒有影響胚胎的發(fā)育。
　　 6.通過對胚胎干重的統(tǒng)計分析,認(rèn)為羅漢果沒有影響胚胎DNA含量和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 7.根據(jù)以上結(jié)論,認(rèn)為羅漢果水煎液在30g/kg時(相當(dāng)于人體臨床用量的100倍)對大鼠胚胎無致畸作