全氟辛烷磺酸鹽的胚胎發(fā)育毒性機(jī)制研究.pdf

1、全氟化合物（perfluorinated compounds，PFCs）是一類全氟性疏水線性碳鏈結(jié)合于多個(gè)親水基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)，以其優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性和低表面自由能等，PFCs 被廣泛用于工業(yè)和生產(chǎn)消費(fèi)領(lǐng)域。全氟辛烷磺酸鹽（perfluorooctane sulfonate，PFOS，C8F17SO3—）作為PFCs的代表性化合物之一，它的前體物質(zhì)和相關(guān)化合物更是被大量應(yīng)用于紡織品、地毯、紙張、食物包裝袋等生產(chǎn)中。
　　 中樞神經(jīng)系

2、統(tǒng)（CNS）由神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞組成，后者包含膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，其中膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中數(shù)量上占絕對優(yōu)勢的細(xì)胞群體，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)框架，在中樞系統(tǒng)疾病研究中，膠質(zhì)細(xì)胞的活化已成為CNS 發(fā)生結(jié)構(gòu)病變的病理特征之一。本文選擇宮內(nèi)暴露的新生鼠、斑馬魚胚胎和鼠類小膠質(zhì)細(xì)胞株（N9細(xì)胞）作為研究對象，設(shè)想PFOS 可能通過活化膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生異常凋亡信號和炎癥反應(yīng)、改變miRNA和基因mRNA 水平，干擾斑馬魚腦組織運(yùn)動神經(jīng)元發(fā)育

3、和細(xì)胞增殖等方式發(fā)揮毒性作用，以探討PFOS 引起發(fā)育毒性的可能機(jī)制。
　　 第一部分 宮內(nèi)PFOS暴露對新生鼠肝、肺、大腦發(fā)育的影響
　　 目的：發(fā)育期大腦對各種外來刺激如外傷、缺氧、氧化應(yīng)激等比成年后的腦組織更敏感，若此時(shí)大腦發(fā)育被阻滯，雖然自身有極輕微的修復(fù)功能，但損傷進(jìn)程將持續(xù)進(jìn)行并可能成為永久性損傷。本研究探討宮內(nèi)較低劑量PFOS暴露引起的大鼠組織病理學(xué)改變及中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的潛在毒性效應(yīng)。方法：將SD大鼠隨機(jī)

4、分為對照組和2.0 mg/kg/day PFOS組，選擇4 ml//kg/day的0.5％ Tween-20 液作為對照，從母鼠受孕后第2日染毒至受孕后第21天管飼給藥。出生后的仔鼠觀察存活率及體重變化，然后麻醉使其安樂死，采用HE染色研究PFOS 引起的主要臟器形態(tài)學(xué)的病理改變；免疫組織化學(xué)ABC染色法觀察腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞的活性及有關(guān)分子表達(dá)；結(jié)果：與對照組0天仔鼠全部存活相比，實(shí)驗(yàn)組存活率僅88.7％（P＜0.01）

5、，體重下降明顯（P＜0.001）。HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組肝臟出現(xiàn)局部缺血及紅細(xì)胞滲出，肝索紋理不清，肝細(xì)胞形成多個(gè)空泡、巨核和多核，以上現(xiàn)象主要在肝門靜脈周圍周圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組肺組織大量充血，肺間隔明顯增厚，肺泡上皮及間質(zhì)細(xì)胞增生，局部出現(xiàn)實(shí)變及輕微肺不張，與出生前的未成熟形態(tài)相似。首次發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)小支氣管管腔內(nèi)被覆的上皮細(xì)胞核變大變圓，排列較紊亂，失去正常纖毛柱狀上皮結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)較幼稚細(xì)胞形態(tài)。腦組織僅見海馬區(qū)細(xì)胞核比對照組染色深的現(xiàn)象。P

6、FOS染毒后，反映小膠質(zhì)細(xì)胞活性的ED-1和EMAP-Ⅱ與對照組相比無差別，星型膠質(zhì)細(xì)胞被激活的標(biāo)志物GFAP表達(dá)出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），炎癥因子AIF-1、參與炎癥反應(yīng)和凋亡發(fā)生的蛋白NF κ B表達(dá)顯著增加，而bak蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)；結(jié)論：較低劑量PFOS主要引起肝、肺組織形態(tài)改變，通過誘發(fā)大鼠腦組織炎癥反應(yīng)以及病理學(xué)凋亡發(fā)揮損傷效應(yīng)。
　　 第二部分 PFOS 誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性及機(jī)制研究
　　 目的

7、：斑馬魚因其易于飼養(yǎng)、發(fā)育快速、性成熟期短、胚胎體外發(fā)育、易于觀察和操作等成為毒理學(xué)研究的重要模式脊椎動物之一。本部分?jǐn)M探討PFOS 對斑馬魚胚胎神經(jīng)和心臟發(fā)育的影響及可能的機(jī)制。方法：受精后6小時(shí)（6 hpf）的斑馬魚胚胎用1 mg/L PFOS染毒至24，96，120，132，144，168和192 hpf，DMSO 作為溶劑對照，實(shí)驗(yàn)中DMSO 作為溶劑，其終濃度不超過0.0025％。觀察不同時(shí)間點(diǎn)兩組胚胎/幼魚死亡率和畸形率；免

8、疫組織化學(xué)方法測定α-tubulin和增殖性細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)；根據(jù)免疫組化結(jié)果提示，采用miRNA 芯片篩選出神經(jīng)發(fā)育相關(guān)miRNAs，并用stem-loop 熒光定量PCR 檢測其表達(dá)；RT-PCR 檢測96和120 hpf 時(shí)cdk5、PrdX2和p53表達(dá)。吖啶澄（AO）染色檢測凋亡細(xì)胞發(fā)生及其部位，根據(jù)miRNA 芯片篩選結(jié)果用stem-loop 熒光定量PCR 檢測心臟發(fā)育相關(guān)miRNAs表達(dá)。結(jié)果：PFOS染毒至1

9、32 hpf后明顯增加斑馬魚胚胎死亡率和畸形率，可觀察到多種發(fā)育畸形如心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲、色素沉著降低、側(cè)游等；α-tubulin分布結(jié)果顯示對照組胚胎在72 hpf和120 hpf 時(shí)腦區(qū)和近尾部2/3 段脊柱區(qū)都存在高表達(dá)；與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組72 hpf和120 hpf 時(shí)腦區(qū)和近尾部2/3 段脊柱區(qū)軸突束的表達(dá)顯著降低，在軀干部分運(yùn)動神經(jīng)元軸突束表達(dá)變得細(xì)而短；但是96 hpf 時(shí)腦區(qū)軸突束表達(dá)無明顯差別，而近尾部2

10、/3 段脊柱區(qū)軸突束的表達(dá)出現(xiàn)顯著增加。PCNA分布結(jié)果顯示對照組72 hpf和96 hpf 時(shí)，斑馬魚胚胎PCNA 僅在腮弓或咽腭弓成點(diǎn)狀表達(dá)模式，端腦、間腦、小腦等部位均未見表達(dá)，軀干脊柱區(qū)表達(dá)成細(xì)線狀，而尾部脊柱區(qū)未見表達(dá)；120hpf 時(shí)在咽腭弓區(qū)出現(xiàn)高表達(dá)，軀干脊柱區(qū)表達(dá)成細(xì)線狀，同時(shí)可見肌原纖維節(jié)有一定量表達(dá)。與對照組相比，1 mg/L PFOS暴露后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)下腹側(cè)和尾部脊柱區(qū)PCNA表達(dá)均明顯增加，此外，在120 hpf

11、后腦區(qū)PCNA 出現(xiàn)點(diǎn)狀分布，而72 hpf和96 hpf時(shí)腦區(qū)未觀察到明顯PCNA表達(dá)。PFOS染毒至120 hpf 引起特異性表達(dá)于腦組織，與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的基因miR-124，miR-128，miR-153 a/b 均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，而miR-181b，miR-125b，miR-430 家族表達(dá)下調(diào)。PFOS暴露至96 hpf和120 hpf 參與神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)的cdk5表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），隨后抑制過氧化物酶基因2表達(dá)的

12、顯著性下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AO染色顯示PFOS 誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞主要環(huán)繞在心臟周圍，PFOS暴露至120 hpf 引起心臟發(fā)育相關(guān)基因miR-138和miR-1表達(dá)顯著性上調(diào)，而miR-133表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：PFOS可引起通過干擾運(yùn)動神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)miRNAs和mRNA表達(dá)影響神經(jīng)和心臟發(fā)育。
　　 第三部分 PFOS 誘導(dǎo)N9 細(xì)胞凋亡及凋亡途徑研究
　

13、　 目的：多種外源性刺激引起的損傷可誘發(fā)病理性凋亡，凋亡發(fā)生有線粒體途徑和死亡受體活化兩種途徑，其中線粒體功能失調(diào)是凋亡的核心檢驗(yàn)點(diǎn)，線粒體膜通透性增加引起線粒體內(nèi)膜區(qū)細(xì)胞色素c 釋放，隨后啟動caspase 級聯(lián)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)PFOS染毒使PC-12 細(xì)胞向膽堿能表型分化，但未見PFOS 引起小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡的報(bào)道。本研究以小膠質(zhì)細(xì)胞系（N9）作為靶細(xì)胞，觀察PFOS 通過線粒體途徑誘發(fā)N9 細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。方法：設(shè)定5，10

14、，50，100,200 μmol/L 五個(gè)PFOS 實(shí)驗(yàn)組，對照組為DMSO 溶劑，各組中溶劑DMSO 終濃度不超過0.5 ％（v/v）。用MTT法觀察染毒24 h和48 h后細(xì)胞活力；PFOS染毒24 h后用PI/FDA 雙染、Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)定量分析凋亡細(xì)胞率；羅丹明123 檢測線粒體膜電位變化，熒光定量PCR 檢測染毒24 h和48 h后凋亡相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2、caspase

15、3和caspase 9基因表達(dá)。結(jié)果：PFOS能顯著降低N9 細(xì)胞活力，同一濃度下染毒48 h后活力下降比24 h 更明顯。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示PFOS 引起劑量-依賴性的凋亡細(xì)胞增加，凋亡率檢測也證實(shí)5～200 μmol/L PFOS染毒引起的凋亡細(xì)胞率分別為3.97％、8.32％、20.81％、33.26％、48.72％，與對照組（2.24％）相比，50 μmol/L及更高劑量PFOS 引起的凋亡增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，PFOS染毒降低