血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子活性測(cè)定的酶聯(lián)免疫分析試劑盒的研制及臨床應(yīng)用.pdf

1、研究背景：
　　 血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一種大分子量的具有粘附功能的多聚體糖蛋白，在止血和血栓過程中發(fā)揮著重要作用。首先，vWF可通過與血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)I b和受損傷內(nèi)皮細(xì)胞暴露的膠原之間的橋聯(lián)作用介導(dǎo)血小板粘附到血管壁：其次，vWF作為凝血因子Ⅷ的載體，保護(hù)因子Ⅷ免受活化的蛋白C降解。vWF量的減少或質(zhì)的異常均能導(dǎo)致血管性血友病(von Will

2、ebrand’sdiseases，vWD)的發(fā)生。vWD是一組高度異質(zhì)性、最常見的出血性疾病之一，資料表明其患病率約為社會(huì)人群的0.1～1％，有出血表現(xiàn)需要治療者約1/1萬。由于vWD患者vWF抗原水平可能正常，因此除檢測(cè)vWF抗原外，還應(yīng)同時(shí)檢測(cè)vWF的活性。血漿vWF瑞斯托霉素輔因子活性(vWF ristocetin cofactor activity，vWF：RCof)測(cè)定是最常用的vWF活性檢測(cè)試驗(yàn)，有利于血管性血友病診斷、分型

3、和治療監(jiān)測(cè)。國(guó)內(nèi)目前主要應(yīng)用血液凝集儀檢測(cè)vWF：Rcof，但其批內(nèi)變異和批間變異都較大；2000年Vanhoorelbeke等報(bào)道了應(yīng)用抗血小板GPIbα單克隆抗體2D4建立血管性血友病因子瑞斯托霉素輔因子活性測(cè)定的酶聯(lián)免疫分析方法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)，該法與聚集法相比批內(nèi)和批間差異??；重復(fù)性好；不需要使用血小板，而使用重組真核表達(dá)GPIbα H1-V289片段(rfGPIb

4、α，H1-V289)。本研究研制了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗血小板GPIbα單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)SZ-151替代國(guó)外的2D4，降低檢測(cè)成本，建立一種操作簡(jiǎn)單，特異性、敏感性高的檢測(cè)方法，并可制成國(guó)產(chǎn)化的ELISA試劑盒，更易于臨床推廣應(yīng)用。為中國(guó)人群中vWD患者尤其是2型vWD的分子病理機(jī)制研究及明確診斷和分型提供更可靠的依據(jù)，有助于臨床醫(yī)生對(duì)vWD的診斷和治療，將具有較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
　　

5、 目的：
　　 (1)制備能用于臨床檢測(cè)血漿vWF：RCof的抗GPIbα的mAb，為開發(fā)診斷試劑盒打下基礎(chǔ)。
　　 (2)制備重組血小板膜糖蛋白Ibα(rfGPIbα)純品。
　　 (3)應(yīng)用抗GPIbα mAb和rfGPIbα建立vWF：Rcof-ELISA方法，對(duì)其進(jìn)行靈敏度、批內(nèi)和批間差異等方法學(xué)考核。
　　 (4)將該方法用于臨床標(biāo)本檢測(cè)并評(píng)價(jià)其臨床診斷價(jià)值。
　　 方法：
　　

6、 (1)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)，制備1株抗GPIba的mAb SZ-151。
　　 (2)用真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞)培養(yǎng)表達(dá)rfGPIbα H1-V289(包含IgG Fc段)，用親和層析法純化rfGPIbα H1-V289，并用生化手段鑒定其純度、免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性。
　　 (3)vWF：RCof-ELISA的建立：以抗GPIbα單抗SZ-151-IgG包板，加入rfGPIbαH1-V289反應(yīng)后，再加入待測(cè)血漿和瑞

7、斯托霉素，小劑量瑞斯托霉素可誘導(dǎo)血漿vWF和GPIbα結(jié)合，最后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記兔抗人vWF多克隆抗體，四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色后，酶標(biāo)儀讀取吸光度值(OD)。
　　 (4)應(yīng)用該方法檢測(cè)36名正常人及25名vWD患者血漿vWF的瑞斯托霉素輔因子活性，對(duì)其靈敏度及批內(nèi)、批間差異進(jìn)行方法學(xué)評(píng)估，與國(guó)外的抗GPIbα單抗2D4-

8、IgG包板所測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，并分析與vWF抗原、膠原結(jié)合實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功制備和鑒定了1株抗人GPIbα mAb，命名為SZ-151。ELISA結(jié)果顯示，SZ-151對(duì)瑞斯托霉素輔因子活性無抑制作用。
　　 (2)每1 L培養(yǎng)上清液可純化獲得2 mg rfGPIbα H1-V289蛋白純品。
　　 (3)成功建立Rcof-ELISA檢測(cè)試劑盒。
　　 (4)其靈敏度：該

9、方法最低檢出限(detection limit，DL)為0.01U/dL。
　　 重復(fù)性：該方法測(cè)定血漿vWF的瑞斯托霉素輔因子活性的批內(nèi)差異和批間差異分別8％和12％。
　　 (5)臨床應(yīng)用：應(yīng)用本法測(cè)定36名正常人及25名vWD患者血漿vWF的瑞斯托霉素輔因子活性，正常人均值為91.5U/dL(47.3-169.2 U/dL)，1型vWD均值為31.8U/dL(22.3.56.9 U/dL)，2A型vWD均值為4.8

10、U/dL(0.6-11.8U/dL)，2B型vWD均值為8.6U/dL(1.6-19.7U/dL)，2M型vWD均值為3.9U/dL(1.0-6.8U/dL)，3型vWD均值為1.0U/dL(0.5-1.6U/dL)。
　　 (6)回歸分析：用SZ-151-IgG和國(guó)外的抗GPIbα單抗2D4-IgG分別包板，所測(cè)vWF：RCof結(jié)果經(jīng)直線回歸分析得r=0.96。該方法與vWF抗原、膠原結(jié)合實(shí)驗(yàn)(vWD的另兩項(xiàng)診斷實(shí)驗(yàn))的相關(guān)性

11、分別為r=0.91和r=0.85，可見有較好的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 (1)獲得1株新的抗GPIba mAb，可用于血漿vWF的瑞斯托霉素輔因子活性檢測(cè)。
　　 (2)獲得具有較高的純度、免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性的rfGPIbα H1-V289蛋白純品。
　　 (3)建立了檢測(cè)vWF：Rcof的ELISA方法，該方法敏感性好、特異性高、重復(fù)性好。
　　 (4)測(cè)定了36例正常人及25例vWD患