維氏固氮菌(Azotobacter vinelandii)的基因轉(zhuǎn)化與應(yīng)用研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以研究自生固氮菌-維氏固氮菌（Azotobacter vinelandii）的工業(yè)應(yīng)用為目的，初步探索提高自生固氮菌-維氏固氮菌（A.vinelandii）固氮效率的方法，初步研究自生固氮菌與纖維素降解菌的混合培養(yǎng)對固氮作用及纖維素降解作用的影響。在液態(tài)自生固氮菌培養(yǎng)基中，通過測定維氏固氮菌（A.vinelandii）w405在不同培養(yǎng)溫度條件下光吸收的不同，確定維氏固氮菌（A.vinelandii）w405的最佳培養(yǎng)溫度。在無氮

2、培養(yǎng)基中，利用考馬斯量亮藍(lán)法測定維氏固氮菌（A.vinelandii）w405在不同培養(yǎng)溫度條件下的菌體蛋白總量，確定維氏固氮菌（A.vinelandii）w405的最佳固氮溫度。根據(jù)GenBank中維氏固氮菌（A.vinelandii）nifA基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR法克隆nifA基因，以pUC19作為載體構(gòu)建質(zhì)粒pNF405后，利用CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pNF405進(jìn)入維氏固氮菌（A.vinelandii）w405。利用凱式定

3、氮法分別在低氮濃度下與高氮濃度下，計(jì)算經(jīng)誘導(dǎo)的維氏固氮菌（A.vinelandii）轉(zhuǎn)化子與未經(jīng)誘導(dǎo)的維氏固氮菌（A.vinelandii）轉(zhuǎn)化子固氮能力的差異。混合培養(yǎng)維氏固氮菌（A.vinelandii）w405和康氏木霉T7，計(jì)算混合培養(yǎng)對維氏固氮菌（A.vinelandii）w405固氮作用的影響。黑曲霉A6，康氏木霉T7和綠色木霉 T5分別和維氏固氮菌（A.vinelandii）w405進(jìn)行混合培養(yǎng)，利用DNS法通過對葡萄糖的

4、測定來計(jì)算和維氏固氮菌（A.vinelandii）w405混合培養(yǎng)對黑曲酶A6，康氏木霉T7和綠色木霉T5的濾紙酶酶活，CMCase酶活，β-葡萄糖苷酶活的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：28℃是維氏固氮菌（A.vinelandii）w405最佳培養(yǎng)溫度也是維氏固氮菌（A.vinelandii）w405的最佳固氮溫度；經(jīng)PCR法成功克隆維氏固氮菌（A.vinelandii）nifA基因，構(gòu)建了質(zhì)粒pNF405，并通過CaCl2轉(zhuǎn)化法成功

5、轉(zhuǎn)化pNF405進(jìn)入維氏固氮菌（A.vinelandii）w405，獲得維氏固氮菌（A.vinelandii）轉(zhuǎn)化子，說明CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化維氏固氮菌（A.vinelandii）是可行的，為其他外源基因的轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了條件。凱式定氮法測定結(jié)果顯示：在低氮濃度條件下誘導(dǎo)的維氏固氮菌（A.vinelandii上差異很小；在高氮濃度條件下差異較為顯著，誘導(dǎo)的維氏固氮菌（A.vinelandii）轉(zhuǎn)化）轉(zhuǎn)化子與非誘導(dǎo)的維氏固氮菌（A.vinela

6、ndii）轉(zhuǎn)化子在固氮能力子在高氮濃度條件下仍具有維氏固氮菌（A.vinelandii）轉(zhuǎn)化子在低氮條件下56％的固氮能力，而非誘導(dǎo)的維氏固氮菌（A.vinelandii）轉(zhuǎn)化子僅有微弱的固氮能力，說明外源nifA基因的轉(zhuǎn)化可以去除高氮濃度對維氏固氮菌（A.vinelandii）固氮作用的限制，提高維氏固氮菌（A.vinelandii）的固氮效率。混合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：維氏固氮菌（A.vinelandii）w405和康氏木酶T7混合培

7、養(yǎng)可明顯提高維氏固氮菌（A.vinelandii）w405的固氮能力，固氮總量提高22%；黑曲霉A6，康氏木霉T7，綠色木霉T5分別和維氏固氮菌（A.vinelandii）w405進(jìn)行的混合培養(yǎng)可明顯提高黑曲霉A6，康氏木霉T7和綠色木霉T5的纖維素酶活。黑曲霉A6的濾紙酶活提高了19.8%，CMC酶活提高了9.4%，β-葡萄糖苷酶活提高了8.0%；康氏木霉 T7的濾紙酶活提高了12.4%，CMC酶活提高了6.5%，β-葡萄糖苷酶活提高