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文檔簡介
1、固氮菌資源的收集挖掘可以幫助微生物肥料的研究與開發(fā),微生物肥料與化肥合理搭配還能提高化肥利用率,在保證作物產(chǎn)量的同時減少成本和污染。本研究以廣西自治區(qū)梧州市藤縣蒙江鎮(zhèn)那塘村一處山洼的藥用野生稻為研究材料,采用三種無氮培養(yǎng)基經(jīng)平板劃線分離法篩選內(nèi)生固氮菌,通過乙炔還原法測定其固氮酶活性和同位素豐度法驗證固氮能力;利用IS-PCR(Insertion sequence-based PCR)指紋圖譜和SDS-PAGE全細胞蛋白電泳指紋圖譜對獲
2、得的內(nèi)生固氮菌進行聚類分析;對于各個類群的代表菌株,根據(jù)16S rRNA基因序列分析確定其分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;使用溶解透明圈法定性檢測溶磷解硅能力;Salkowski比色法定量測其產(chǎn)生長素能力;鉬銻抗比色法定量測其溶磷能力;2,4-二硝基苯肼比色法定量測其 ACC脫氨酶活性;絡(luò)天氰(CAS)法檢測產(chǎn)鐵載體。主要得出以下研究結(jié)果:
?。?)從供試材料中分離純化獲得34株內(nèi)生固氮菌,其固氮酶活性介于5.0到1036.7 nmol/mL
3、?h之間。分離獲得的菌株用IS-PCR指紋圖譜和SDS-PAGE全細胞蛋白電泳指紋圖譜可聚為5個類群,類群I和II各有8株,類群III、IV、V分別有2株、5株和11株。固氮酶活性最高的菌株HU31,同位素豐度法檢測15N同位素豐度達到25.15%,超過自然豐度0.36%。
?。?)各個類群代表菌株16S rRNA基因序列分析表明:類群I代表菌株HU33與無乳固氮螺菌(Azospirillum amazonenseATCC351
4、19T)相似性為97.13%;類群II代表菌株HU31與變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicolaDSM15968T)相似性為99.71%;類群III代表菌株HU17與蒙氏假單胞菌(Pseudomonas monteiliiATCC700476T)相似性為99.86%;類群IV代表菌株HU13與黃黃色桿菌(Xanthobacter flavusATCC35867T)相似性為100%;類群 V代表菌株 CM05與越南伯克霍爾
5、德菌(Burkholderia vietnamiensisLMG10929T)相似性為99.86%。
?。?)代表菌株HU31和CM05都可以溶磷脫硅;比色法定量測出菌株HU31和CM05的解磷能力分別為105.4±6.9μg/mL和71.8±9.0μg/mL。代表菌株HU31、HU17和CM05有產(chǎn)鐵載體能力。5個類群的代表菌株都具有產(chǎn)生長素能力,在有色氨酸存在的情況下,菌株HU13、HU17和HU31的產(chǎn)生長素能力顯著高于沒
6、有色氨酸存在的時候,說明這三株內(nèi)生菌生長素合成途徑依賴色氨酸。5個類群代表菌株都具有ACC脫氨酶活性。
(4)代表菌株HU31在低氮液體培養(yǎng)情況下,使充滿N2的密封塑料瓶凹陷。
本研究分離篩選的野生稻內(nèi)生固氮菌具有生物多樣性,并且具有一定的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用潛力,為微生物肥料生產(chǎn)收集了菌種資源;類群I代表菌株HU33可能是一個新類群,有待于DNA雜交和電子顯微鏡觀察進一步驗證;類群II代表菌株HU31在低氮液體培養(yǎng)情況下也
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