鉤端螺旋體表達(dá)譜的研究及噬菌體片段轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)研究.pdf

1、鉤端螺旋體簡稱鉤體，屬于螺旋體目(Spirochaetals)螺旋體科(Spirochaetaleae)鉤端螺旋體屬。其中致病性鉤體引起鉤體病(Leptospirosis)，此病人獸共患并呈全球分布。人通過直接或間接接觸感染動(dòng)物的尿液而感染。鉤體病(Leptospirosis)l的臨床特點(diǎn)為高熱、頭痛、寒戰(zhàn)、乏力、淋巴結(jié)腫大和明顯的肌肉疼痛。重者可并發(fā)肺出血、黃疸、腦膜腦炎和腎功能衰竭等。由于缺乏有效的遺傳工具，對(duì)鉤端螺旋體的研究，尤其

2、對(duì)其致病機(jī)制的研究還相對(duì)較困難，因此對(duì)其致病機(jī)理的研究還不是很深入。 鉤端螺旋體的全基因組測(cè)序工作已于2002年完成，本實(shí)驗(yàn)室于2004年根據(jù)注釋的ORFs設(shè)計(jì)了鉤端螺旋體的cDNA芯片。依據(jù)ORF注釋，對(duì)堿基序列>150bp的ORF設(shè)計(jì)特異引物，共設(shè)計(jì)3582個(gè)ORF，并以此PCR產(chǎn)物構(gòu)建芯片，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)三次。鉤端螺旋體共注釋了4528個(gè)ORF，此基因芯片包含了全部注釋基因的79.1％。本試驗(yàn)利用鉤端螺旋體的cDNA芯片，分別

3、研究了毒力株和減毒株，以及不同傳代的毒力株表達(dá)譜的差異。 鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株[＃]56601(中賴)與鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株減毒株(法賴)在遺傳背景上具有很大的相似性，但毒力卻有很大的差別。本試驗(yàn)以37℃為試驗(yàn)的培養(yǎng)條件，以體外37℃培養(yǎng)的鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株[＃]56601(中賴)為測(cè)試株(tester)，以鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株減毒株(法賴)為對(duì)照株(refenence)，利用鉤端螺

4、旋體的cDNA芯片測(cè)試了不同毒力株芯片表達(dá)譜的差異。結(jié)果表明在37℃培養(yǎng)條件下，毒力株和減毒株的表達(dá)譜具有明顯的差別。37℃培養(yǎng)時(shí)，毒力株中賴上調(diào)表達(dá)的基因有101個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有71個(gè)。這些差異表達(dá)的基因在功能上可以分i0類。參照NCBI COGs功能分類，在上調(diào)表達(dá)的基因中，溶血素基因2個(gè)，脂蛋白基因2個(gè)，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)基因11個(gè)，防御機(jī)制相關(guān)基因2個(gè)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控基因8個(gè)，膜蛋白基因及膜蛋白發(fā)生基因11個(gè)，細(xì)胞動(dòng)力基因5個(gè)

5、，分泌基因2個(gè)，蛋白翻譯后修飾及折疊基因7個(gè)，新陳代謝相關(guān)基因29個(gè)，其它為功能未知蛋白基因。在下調(diào)表達(dá)的基因中，轉(zhuǎn)運(yùn)及結(jié)合蛋白2個(gè)，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)基因21個(gè)，防御機(jī)制相關(guān)基因2個(gè)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控基因6個(gè)，膜蛋白基因及膜蛋白發(fā)生基因4個(gè)，細(xì)胞動(dòng)力基因1個(gè)，分泌基因2個(gè)，蛋白翻譯后修飾及折疊基因1個(gè)，新陳代謝相關(guān)基因16個(gè)，其它為功能未知蛋白基因。這些差異表達(dá)的基因可能在鉤端螺旋體毒力株致病方面發(fā)揮一定的作用。 致病性鉤端

6、螺旋體又可分為毒力株和減毒株。減毒株是由于鉤端螺旋體在體外傳代超過200次而導(dǎo)致的毒力大大減弱而造成的。很多研究認(rèn)為鉤端螺旋體在體外傳代超過10次就會(huì)造成毒力的減弱，在傳代20次后鉤端螺旋體的形態(tài)就發(fā)生了較為明顯的變化，其一些生理學(xué)性質(zhì)也發(fā)生了明顯的改變。 為了能夠在全基因組水平上研究體外培養(yǎng)過程中引起鉤端螺旋體發(fā)生變化的分子機(jī)制，本試驗(yàn)利用鉤端螺旋體的aDNA芯片研究了鉤端螺旋體在體外培養(yǎng)第一代與第五代、第十代及第二十代表達(dá)譜

7、的差異。從芯片的結(jié)果來看，中賴第一代和第五代及第一代和第十代相比差異表達(dá)基因分別為57個(gè)和80個(gè)，而第一代和第二十代相比差異表達(dá)的基因?yàn)?70個(gè)。這一結(jié)果證實(shí)了鉤端螺旋體在體外傳代少于10次時(shí)，鉤端螺旋體未發(fā)生很明顯的毒力及其它方面的改變。而當(dāng)體外傳代多于二十次后，鉤端螺旋體體內(nèi)發(fā)生了較為明顯的變化。變化較為明顯基因包括細(xì)胞膜及膜生成相關(guān)基因，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因及細(xì)胞動(dòng)力相關(guān)基因，這些發(fā)生明顯改變的基因可能與以前試驗(yàn)所報(bào)道的細(xì)胞膜分子的變

8、化及細(xì)胞形態(tài)的變化及細(xì)胞的致病力有關(guān)。同時(shí)新陳代謝相關(guān)基因也發(fā)生了較為復(fù)雜的變化，這可能是鉤端螺旋體適應(yīng)體外環(huán)境的結(jié)果。 同時(shí)在本試驗(yàn)中第一代和第二十代的芯片結(jié)果中還有兩段共調(diào)控的基因，這一共調(diào)控的基因片段的功能還不是很清楚。在第三章我們將進(jìn)一步研究其功能及其調(diào)控。 在很多細(xì)菌基因組中，都有噬菌體基因或者是噬菌體片斷的存在。噬菌體DNA作為重要的基因水平轉(zhuǎn)移載體，在致病菌的毒力進(jìn)化過程中起著重要的作用。噬菌體作為細(xì)菌的一

9、個(gè)獨(dú)立存在的遺傳單位，既可以獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外也可以整合于細(xì)菌染色體之上，所以成為研究細(xì)菌基因組學(xué)的一個(gè)重要遺傳工具。到目前為止，致病性鉤端螺旋體中一直沒有分離到噬菌體顆粒存在。本試驗(yàn)首先用生物信息學(xué)方法，利用已知的噬菌體序列對(duì)LA01 83一LA0221片段做了BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／)和蛋白保守區(qū)的分析(http：//pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml)。分析

10、表明在這一片段上，存在有較多的噬菌體同源序列，它們分別與整合酶基因、一噬菌體調(diào)控基因及噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白具有相似性。其中LA0195蛋白具有明顯的噬菌體調(diào)控蛋白CI蛋白保守域及DNA結(jié)合域。LA0184與整合酶有較低的相似性，LA0189與Mu噬菌體的gam蛋白有較高的相似性，LA0205、LA0211及LA0215均為類噬菌體結(jié)構(gòu)基因。本試驗(yàn)從操縱子結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子序列、及cI基因的功能對(duì)此片段做了研究。 運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，在相

11、鄰的基因之間跨相鄰基因設(shè)計(jì)PCR引物，共設(shè)計(jì)了覆蓋LA0183-LA0219的20對(duì)引物，做RT-PCR研究此片段的基因共轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，此片段共包含5個(gè)轉(zhuǎn)錄子，從左到右依次為：LA0183-LA0185為正向共轉(zhuǎn)錄、LA0186-LA0194為反向共轉(zhuǎn)錄、LA0196-LA0197為反向共轉(zhuǎn)錄、LA0198-LA0202為正向共轉(zhuǎn)錄、LA0203-LA0219，為正向共轉(zhuǎn)錄。 由于LA0195為C／的同源蛋白。在多數(shù)噬菌體中，

12、CI蛋白主要結(jié)合在鄰近的特異DNA序列上以調(diào)控噬菌體基因表達(dá)。因此，我們首先對(duì)LA0195鄰近的序列做了生物信息學(xué)分析。第果表明，在LA0194基因與LA0195基因的基因間序列存在有一正向重復(fù)序列和一反向重復(fù)序列。由于啟動(dòng)子序列上也有特異的DNA—binding域，我們運(yùn)用http：//www.soflberry.com／berrv.phtml．軟件，對(duì)鄰近LA0195蛋白的LA0195、LA0194及LA0198基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行

13、了預(yù)測(cè)并把預(yù)測(cè)的序列克隆到啟動(dòng)子載體pKK232-8中以進(jìn)一步證實(shí)啟動(dòng)子的活性。通過氯霉素篩選及CAT-ELLISA試驗(yàn)，LA0195及LA0194啟動(dòng)子在大腸桿菌中具有很強(qiáng)的啟動(dòng)活性，而LA0198的啟動(dòng)子沒有很明顯的啟動(dòng)活性。 LA0194及LA0195啟動(dòng)子均包含了LA0195與LA0194之間的重復(fù)序列。為了證明LA0195蛋白是否具有結(jié)合以上調(diào)控序列的功能，我們?cè)隗w內(nèi)對(duì)LA0195蛋白進(jìn)行了克隆表達(dá)和純化。為了測(cè)定LA

14、0195蛋白的結(jié)合能力，我們對(duì)LA0194、LA0195及LA0198的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了生物素標(biāo)記，用pierce公司的EMSA試劑盒在體外做了LA0195蛋白與啟動(dòng)子的體外結(jié)合試驗(yàn)，結(jié)果表明，LA0195蛋白與LA0194啟動(dòng)子及LA0195啟動(dòng)子均有結(jié)合活性。這說明LA0195蛋白在體內(nèi)還應(yīng)具有一定的調(diào)控能力。 本試驗(yàn)首次對(duì)鉤端螺旋體的類噬菌體序列做了研究。一般來講，噬菌體序列對(duì)宿主都有一定的貢獻(xiàn)，如在致病性及抗藥性方面起一