Dok5在神經系統(tǒng)中的功能研究——Dok5參與Neurotrophin信號轉導的研究.pdf

1、Neurotrophins在神經細胞的增殖、分化、存活、遷移、凋亡、突觸的可塑性，維持神經元的正常生理功能以及學習和記憶等高級功能中具有非常重要的作用。Trk(_tropomyosin-relatedkinase，原肌球蛋白相關激酶)受體是neurotrophins的高親合力受體，是細胞膜表面的受體酪氨酸激酶，該家族包括在結構上高度同源的3個成員：TrkA、TrkB和TrkC。在neurotrophins刺激下，Trk受體迅速二聚體化并

2、激活其自身的酪氨酸激酶活性，活化的受體能夠募集多種信號蛋白并將它們磷酸化，從而將信號由胞外轉導到胞內。 Dok(downstreamoftyrosinekinase/Dockingprotein)家族蛋白是胞漿接頭蛋白，參與多個信號通路的轉導。該家族蛋白具有信號蛋白典型的結構特征：N端的PH結構域、中央的PTB結構域以及C端區(qū)域。目前發(fā)現(xiàn)的該家族成員有6個：Dok1、Dok2、Dok3、Dok4、Dok5和Dok6。其中，Do

3、k1、Dok2和Dok3主要在血液系統(tǒng)中表達，Dok4在多種組織中表達，Dok5主要在神經系統(tǒng)和肌肉中表達，Dok6主要在神經系統(tǒng)中表達。Dok家族蛋白可作為酪氨酸激酶的底物，參與調控多個信號通路。很多酪氨酸激酶，包括非受體酪氨酸激酶(如Src家族激酶)，以及受體酪氨酸激酶(如胰島素受體，B細胞受體，c-Ret受體等)都可以磷酸化Dok蛋白，從而調節(jié)下游信號。 人Dok5全長cDNA由本室(胡松年、談昕煜)于1998年從人胎腦

4、cDNA文庫中分離克隆，并提交Genebank，其接收號為NM018431。本室先前的表達譜分析(唐開福、康立山等)表明Dok5主要在神經系統(tǒng)和肌肉組織中表達。結合本室早期的工作基礎，我們繼續(xù)進行了Dok5在神經系統(tǒng)中的功能研究。結合生物信息學的分析和相關文獻線索，我們預測Dok5可能參與神經系統(tǒng)特異表達的Trk家族受體介導的信號轉導。為了證明這個設想，我們首先應用了酵母雙雜交實驗來檢測Trk家族受體和Dok5間是否具有相互作用，結果證

5、明在酵母雙雜交系統(tǒng)中Dok5與TrkB、TrkC胞內區(qū)有強相互作用，而與TrkA的相互作用很弱。通過結構域分段驗證實驗，我們證明Dok5通過其PTB結構域結合TrkB、TrkC受體。隨后我們在Pulldown實驗和Co-IP實驗中驗證了它們的相互作用。通過氨基酸突變分析我們進一步確定了Dok5結合TrkB、TrkC受體的NPQY模體，這種結合依賴酪氨酸的磷酸化。在激光共聚焦實驗中，Dok5和TrkB、TrkC受體在正常和分化的PC12細

6、胞中共定位。通過競爭實驗，我們證明Dok5可以和N-Shc競爭結合TrkB、TrkC受體。為了確定Dok5在neurotropin信號通路中的作用，我們檢測了Dok5對MAPK信號通路的影響，結果顯示Dok5可以增強TrkB、TrkC受體介導的MAPK通路的活化水平并延長其活化時間。 綜上，我們證明了Dok5以依賴于磷酸化的方式結合TrkB、TrkC受體，并參與TrkB、TrkC受體介導的MAPK信號通路的活化。這為進一步揭示