Dok5在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能研究——Dok5參與Neurotrophin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、Neurotrophins在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、存活、遷移、凋亡、突觸的可塑性，維持神經(jīng)元的正常生理功能以及學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)功能中具有非常重要的作用。Trk(_tropomyosin-relatedkinase，原肌球蛋白相關(guān)激酶)受體是neurotrophins的高親合力受體，是細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶，該家族包括在結(jié)構(gòu)上高度同源的3個(gè)成員：TrkA、TrkB和TrkC。在neurotrophins刺激下，Trk受體迅速二聚體化并

2、激活其自身的酪氨酸激酶活性，活化的受體能夠募集多種信號(hào)蛋白并將它們磷酸化，從而將信號(hào)由胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)。 Dok(downstreamoftyrosinekinase/Dockingprotein)家族蛋白是胞漿接頭蛋白，參與多個(gè)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。該家族蛋白具有信號(hào)蛋白典型的結(jié)構(gòu)特征：N端的PH結(jié)構(gòu)域、中央的PTB結(jié)構(gòu)域以及C端區(qū)域。目前發(fā)現(xiàn)的該家族成員有6個(gè)：Dok1、Dok2、Dok3、Dok4、Dok5和Dok6。其中，Do

3、k1、Dok2和Dok3主要在血液系統(tǒng)中表達(dá)，Dok4在多種組織中表達(dá)，Dok5主要在神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉中表達(dá)，Dok6主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。Dok家族蛋白可作為酪氨酸激酶的底物，參與調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路。很多酪氨酸激酶，包括非受體酪氨酸激酶(如Src家族激酶)，以及受體酪氨酸激酶(如胰島素受體，B細(xì)胞受體，c-Ret受體等)都可以磷酸化Dok蛋白，從而調(diào)節(jié)下游信號(hào)。 人Dok5全長(zhǎng)cDNA由本室(胡松年、談昕煜)于1998年從人胎腦

4、cDNA文庫(kù)中分離克隆，并提交Genebank，其接收號(hào)為NM018431。本室先前的表達(dá)譜分析(唐開福、康立山等)表明Dok5主要在神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉組織中表達(dá)。結(jié)合本室早期的工作基礎(chǔ)，我們繼續(xù)進(jìn)行了Dok5在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能研究。結(jié)合生物信息學(xué)的分析和相關(guān)文獻(xiàn)線索，我們預(yù)測(cè)Dok5可能參與神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)的Trk家族受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了證明這個(gè)設(shè)想，我們首先應(yīng)用了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)Trk家族受體和Dok5間是否具有相互作用，結(jié)果證

5、明在酵母雙雜交系統(tǒng)中Dok5與TrkB、TrkC胞內(nèi)區(qū)有強(qiáng)相互作用，而與TrkA的相互作用很弱。通過(guò)結(jié)構(gòu)域分段驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，我們證明Dok5通過(guò)其PTB結(jié)構(gòu)域結(jié)合TrkB、TrkC受體。隨后我們?cè)赑ulldown實(shí)驗(yàn)和Co-IP實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了它們的相互作用。通過(guò)氨基酸突變分析我們進(jìn)一步確定了Dok5結(jié)合TrkB、TrkC受體的NPQY模體，這種結(jié)合依賴?yán)野彼岬牧姿峄?。在激光共聚焦?shí)驗(yàn)中，Dok5和TrkB、TrkC受體在正常和分化的PC12細(xì)

6、胞中共定位。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，我們證明Dok5可以和N-Shc競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TrkB、TrkC受體。為了確定Dok5在neurotropin信號(hào)通路中的作用，我們檢測(cè)了Dok5對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示Dok5可以增強(qiáng)TrkB、TrkC受體介導(dǎo)的MAPK通路的活化水平并延長(zhǎng)其活化時(shí)間。 綜上，我們證明了Dok5以依賴于磷酸化的方式結(jié)合TrkB、TrkC受體，并參與TrkB、TrkC受體介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的活化。這為進(jìn)一步揭示