枯草芽胞桿菌Bs916產(chǎn)羅克霉素、表面活性素、桿菌霉素和泛革素的結(jié)構(gòu)鑒定、合成途徑及生物學(xué)功能.pdf

1、枯草芽胞桿菌是一種重要的生防微生物，能在環(huán)境中很好的定殖和能分泌豐富的次生抗菌代謝物質(zhì)，已成功的應(yīng)用于多種植物病害的防治?？莶菅堪麠U菌分泌的脂肽類抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草素(iturin)和泛革素(fengycin)對(duì)植物病原真菌、細(xì)菌和卵菌都具有重要的抗菌活性;在植物病害的生物防治中具有潛在的用途而被廣泛深入研究。為進(jìn)一步闡明商品化枯草芽胞桿菌Bs916在防治植物病害的生化分子機(jī)理，本論文在Bs916全基因組框架

2、測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bs916含有9個(gè)次生抗菌代謝產(chǎn)物基因簇，初步推測(cè)其具有潛在分泌近十種次生抗菌代謝產(chǎn)物的能力。讓我們最感興趣的是Bs916基因組中含有四種潛在合成脂肽類抗生素的基因簇，除了三種已知的分別負(fù)責(zé)表面活性素合成的基因簇srf,桿菌霉素L合成的基因簇bmy，泛革素合成的基因簇en，還含有一個(gè)低同源性的新型羅克霉素的基因簇loc。對(duì)Bs916發(fā)酵液中脂肽類抗生素進(jìn)行初步提取，生物活性實(shí)驗(yàn)表明初提物具有廣譜的抗真

3、菌活性和細(xì)菌活性。采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)到初提物中除了表面活性素、桿菌霉素L和泛蘋素的質(zhì)譜峰外，還檢測(cè)到分子質(zhì)量相差一個(gè)亞甲基的3個(gè)質(zhì)譜峰，推測(cè)屬于新型脂肽類抗生素的質(zhì)譜峰。
　　對(duì)枯草芽胞桿菌Bs916基因組中低同源性的非核糖體合成途徑（NRPS）的基因簇（loc）的生物信息學(xué)分析表明loc基因簇含有四個(gè)開放閱讀框，分別編碼四個(gè)復(fù)合酶locA、locB、locC和locD，含有六個(gè)腺苷酰化結(jié)構(gòu)域(Adomain)。通過

4、同源重組破壞羅克霉素中關(guān)鍵基因和重組表達(dá)腺苷?；Y(jié)構(gòu)域的結(jié)果證明loc基因簇負(fù)責(zé)羅克霉素的生物合成。采用高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜的方法檢測(cè)羅克霉素的分子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)羅克霉素的分子質(zhì)量也包括相差一個(gè)亞甲基的3個(gè)質(zhì)譜峰，與Bs916發(fā)酵液中檢測(cè)到的3個(gè)新型質(zhì)譜峰完全一致。進(jìn)一步通過酸沉淀、有機(jī)溶劑抽提、固相萃取和制備性高效液相色譜得到羅克霉素3個(gè)同系物的純品。采用氨基酸分析、多級(jí)質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)闡明了羅克霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。羅克霉素是由含有9個(gè)氨

5、基酸殘基的多肽鏈與含有13～15個(gè)碳原子的脂肪酸鏈通過酰胺鍵相連形成的環(huán)脂肽類抗生素。將羅克霉素和已知的脂肽類抗生素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)羅克霉素屬于一類新型的脂肽類抗生素家簇。對(duì)羅克霉素的生物活性測(cè)定表明，羅克霉素對(duì)多種病原細(xì)菌和病毒都具有較高的抑制活性，尤其是羅克霉素具有較低的溶血活性表明其在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。另外，根據(jù)羅克霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和loc基因簇的特征，本論文還提出了一條羅克霉素生物合成代謝途徑，該非核糖體合成

6、途徑包含以下幾個(gè)非典型的特征:1）非線性的合成機(jī)制，如結(jié)構(gòu)域忽略，重復(fù)使用和選擇性變化等;2）催化環(huán)肽的N-?；毙揎?3）環(huán)化9個(gè)氨基酸殘基的特異硫酯酶結(jié)構(gòu)域。環(huán)脂肽抗生素羅克霉素結(jié)構(gòu)的解析和合成基因簇的鑒定，為進(jìn)一步詳細(xì)探明含有六個(gè)模塊的非糖體基因簇催化含有九個(gè)氨基酸殘基的環(huán)脂肽類化合物的非線性合成機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　最近的研究表明脂肽類抗生素還能調(diào)節(jié)枯草芽胞桿菌典型生物學(xué)性狀:抗菌活性、溶血活性、游動(dòng)性、生物膜和菌落形態(tài)等

7、來影響枯草芽胞桿菌的生物防治效果。通過基因組分析和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Bs916中含有四種脂肽類抗生素表面活性素、桿菌霉素L、泛革素和羅克霉素的基因簇。為進(jìn)一步研究這四種脂肽類抗生素基因簇對(duì)枯草芽胞桿菌生物學(xué)性狀的影響，本論文通過同源重組構(gòu)建了八個(gè)單基因、雙基因或三基因敲除突變株，它們分別喪失一種、兩種或三種脂肽類抗生素的合成。通過對(duì)這些突變株的生物學(xué)性狀研究表明桿菌霉素L和泛革素基因簇的突變顯著降低了Bs916的抗真菌活性;表面活

8、性素基因簇的突變株抗真菌活性也顯著降低，推測(cè)可能是表面活性素合成基因簇的突變影響了桿菌霉素L和泛革素的合成;除了泛革素基因簇突變株之外，其他三種脂類抗生素基因簇的突變都顯著影響B(tài)s916的菌落形態(tài);盡管羅克霉素和泛革素基因簇的突變對(duì)Bs916的溶血活性、游動(dòng)性和生物膜形成影響甚微，但表面活性素和桿菌霉素L基因簇的突變對(duì)Bs916的溶血活性、游動(dòng)性和生物膜形成影響顯著?？偠灾砻婊钚运?、桿菌霉素L、泛革素和羅克霉素基因簇對(duì)Bs916典

9、型性狀的影響是各具特點(diǎn)、貢獻(xiàn)不一和協(xié)同增效。
　　表面活性素、桿菌霉素L、泛革素和羅克霉素具有廣譜的抗菌活性和溶血活性，在生物技術(shù)和生物制藥領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，除了表面活性素有商品化生產(chǎn)外，其它三種抗生素目前都沒有商品化純品生產(chǎn)。本論文報(bào)道了從枯草芽胞桿菌916突變株的發(fā)酵液中快速分離純化這四種脂肽類抗生素的提取方法，并對(duì)制備的純品進(jìn)行了生物活性分析。通過選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冎臧l(fā)酵，采用酸沉淀，有機(jī)溶劑抽提和固相萃取的方法我

10、們制備了表面活性素、桿菌霉素L、泛革素和羅克霉素純品。生物活性分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表面活性素和桿菌霉素L具有較強(qiáng)的溶血活性，泛革素和羅克霉素的溶血活性較弱;桿菌霉素L和泛革素具有較強(qiáng)的抗真菌活性，而表面活性素和羅克霉素具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌和病毒的活性;表面活性素和桿菌霉素L能部分恢復(fù)相應(yīng)突變株游動(dòng)性和生物膜的形成能力。這四種脂肽類抗生素純品的制備為以后進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　生防枯草芽胞桿菌Bs916對(duì)水稻紋枯病具有

11、很好的防治效果。盡管枯草芽胞桿菌916產(chǎn)生的脂肽類抗生素的抗菌活性被闡明，但是關(guān)于脂肽類抗生素影響枯草芽胞桿菌916在環(huán)境中定殖能力的報(bào)道甚少?？莶菅堪麠U菌Bs916，水稻葉鞘和水稻紋枯病菌的相互作用為研究枯草芽胞桿菌在植物葉面的定殖能力提供一個(gè)很好的研究模型。在構(gòu)建表面活性素突變株△srf、桿菌霉素L突變株△bmy和雙突變株△srf+bmy的基礎(chǔ)上，本論文采用綠色熒光蛋白標(biāo)記的手段研究了野生型枯草芽胞桿菌Bs916和其突變株在水稻葉鞘

12、的定殖能力。研究結(jié)果表明野生型枯草芽胞桿菌Bs916能很好的在水稻葉鞘的病斑部位形成生物膜，具有良好的定殖能力;然而突變株不能在水稻葉鞘病斑部位形成生物膜，基本喪失了定殖能力。進(jìn)一步通過盆栽防效實(shí)驗(yàn)表明野生型枯草芽胞桿菌Bs916對(duì)水稻紋枯病菌具有較好的防治效果，而三個(gè)突變株對(duì)水稻紋枯病的防治效果都顯著下降。簡(jiǎn)而言之，表面活性素和桿菌霉素L是通過各自的作用機(jī)理，以協(xié)同的作用方式影響枯草芽胞桿菌Bs916的抗真菌活性、生物膜形成和田間定殖