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文檔簡介
1、第一章:PAPP-A在大鼠頸動脈球囊損傷后的表達及白藜蘆醇干預作用 目的:制作大鼠頸動脈球囊拉傷模型,觀察大鼠頸總動脈球囊損傷后血管平滑肌細胞(VSMCs)增生反應,血漿TNF-a水平的改變,血管壁表達PAPP-A水平及其與血管內膜增殖的關系,以及白藜蘆醇(Resveratrol,Res)對其的影響,為臨床血管成形術后再狹窄的預防和治療提供新的思路。 方法:72只Wistar大鼠隨機分為假手術組(shame group)
2、,手術組(operation group)和干預組(intervention group),每組各24只。干預組于手術前一周及術后灌胃給白藜蘆醇50mg/kg/天,余兩組用等量生理鹽水。采用頸中切口,假手術組單行血管分離,手術組及干預組行頸總動脈球囊拉傷術。術后1、7和14天,每組各處死大鼠8只。經左室抽血5ml,靜止后離心3000轉/分,10min,離心后獲得的血漿置于-20℃冰箱備用。隨后剪開右心室,經左心室用4%多聚甲醛灌注,采用
3、頸中切口取出左頸總動脈1.5cm左右,放入4%甲醛液中固定24小時,常規(guī)制成蠟塊;擬行RT-PCR頸動脈標本直接獲取后迅速放入凍存管中,轉移到液氮中保存?zhèn)溆谩S^察頸總動脈形態(tài)學變化并進行形態(tài)學參數測量:外、內彈力板包繞面積、管腔面積,中膜面積并計算新生內膜面積、新生內膜面積/中膜面積比值(IA/MA)、及管腔狹窄指數(管腔面積/內彈力板包繞面積),并進行統(tǒng)計學分析;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿TNF-a水平,免疫組織化學檢測血
4、管壁增殖細胞核抗原(PCNA)的表達,反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測血管管壁中妊娠相關血漿蛋白-A(PAPP-A)的表達水平。 結果: 1.1天時,光鏡下假手術組血管內皮細胞和內彈力板完整,手術組及干預組血管內皮細胞消失,有時內彈力板撕裂。7天時時,手術組及干預組可見明顯的內膜增生,增生的血管平滑肌細胞排列比較紊亂,進入管腔,使管腔面積減?。?4d時,手術組及干預組內膜增生進一步加重,程度不一,增生細胞排列明顯
5、紊亂,使管腔明顯狹窄。 2.血管形態(tài)學參數的結果:與假手術組比手術組和干預組7和14d時,外、內彈力板包繞面積,中膜面積無顯著差異(P>0.05)。管腔面積、IA/MA、管腔狹窄指數有顯著改變(P<0.01);7天及14天時與手術組比較,干預組管腔面積(LA)擴大(P<0.01),新生內膜面積/中膜面積(IA/MA)顯著減小,管腔狹窄指標顯著減小(P<0.01); 3.血漿TNF-a水平:對照組血漿中TNF-α在1天、7
6、天及14天時間的變化差異性不顯著,無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。手術組血漿中TNF-α在1天時到達高峰(P<0.01),7天時有顯著降低,但仍然較對照組明顯升高(P<0.01),14天時恢復正常水平;干預組血漿中TNF-α水平在1天時顯著升高,但較手術組顯著降低(P<0.01),7天時較手術組顯著降低(P<0.01),和正常組無顯著差異(P>0.05)。14天時,血漿TNF-a水平較7天時進一步降低(P=0.025)和正常水平無顯著區(qū)別
7、(P>0.05)。 4.血管壁PCNA表達:假手術組血管內膜未見明顯PCNA陽性表達,中膜可見少量表達,手術組與藥物治療組中1d中膜可見少量PCNA表達,7d時血管中膜、新生內膜可見大量表達,手術組較干預組顯著增多(P<0.01);14d時兩組中膜、新生內膜表達減少;與手術組比較干預組PCNA陽性表達較手術組顯著減少(P<0.01)。 5.血管壁PAPP-A mRNA的表達:假手術組低水平表達PAPP-A mRNA,損傷
8、7d后,手術組PAPP-A mRNA有明顯表達且較干預組顯著升高(23.63±0.49 VS12.88±0.43,P<0.01),損傷14d后手術組及干干預組血管壁中PAPP-AmRNA表達量進一步增加,與藥物治療組比較手術組的PAPP-AmRNA表達量顯著升高(42.62±0.59 VS29.69±0.36,P<0.01)。 結論: 1.單純球囊拉傷建立大鼠頸總動脈內膜增生模型方便、可靠。 2.血漿中TNF-a
9、、血管壁組織PAPP-AmRNA,PCNA在球囊損傷后2周內血管壁有-顯著表達,在急性損傷期內的水平與血管壁的增生程度相關。 3.白藜蘆醇能顯著降低血漿TNF-a水平,抑制血管壁PAPP-AmRNA,PCNA的表達、能減輕新生血管內膜的增生,擴大管腔面積。 第二章:TNF-a對VSMCs PAPP-A表達、細胞周期影響及白藜蘆醇干預作用 目的:采用復合膠原酶解離法進行大鼠胸主動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng),為心血管疾病
10、血管平滑肌細胞的體外研究提供簡單,高純度的原代細胞培養(yǎng)方法;觀察腫瘤壞死因子-a(TNF-a)對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)妊娠相關蛋白-A(PAPP-A)mRNA的表達、細胞周期及增殖活力的影響,及白藜蘆醇(Res)的干預作用,探討白藜蘆醇抗血管平滑肌增殖的可能作用機制。為臨床研究抗血管成形術后再狹窄的治療靶點選擇提供理論依據。 方法:采用Wistar大鼠腹主動脈,利用復合膠原酶解離法進行大鼠胸主動脈平滑肌細胞的原代
11、培養(yǎng),利用細胞形態(tài)學及平滑肌細胞a-actin染色,鑒定血管平滑肌細胞的純度;將細胞傳代到4~6代后行干預實驗:(一)1)將細胞分組:空白對照組單純給予10%的DMEM培養(yǎng)基;TNF-a刺激組TNF-a刺激組以10ng/mL濃度刺激1、4、8、24h,2)將細胞分組:空白對照組單純給予10%的DMEM培養(yǎng)基;TNF-a刺激組以10-1,100,101,102 ng/mL濃度的TNF-a刺激VSMCs8h。觀察不同濃度的TNF-a對PAP
12、P-A mRNA表達的影響。3)將細胞分組:空白對照組單純給予10%的DMEM培養(yǎng)基;TNF-a刺激組以10ng/mL的TNF-a濃度刺激;白藜蘆醇干預組用不同濃度(10-8~10-4 mol/L)的白藜蘆醇預處理6h后,再用10 ng/mL TNF-a刺激8h。觀察白藜蘆醇對TNF-a誘導血管平滑肌細胞PAPP-AmRNA表達的影響。(二)1)將細胞分為空白對照組、TNF-a刺激組(10-1~10210ng/mL)、白藜蘆醇組(10-
13、8~10-4 mol/L)、自藜蘆醇干預組(10-8~10-4 mol/LRes+10ngTNF-a)作用24h,觀察TNF-a、Res對血管平滑肌細胞細胞周期的影響及白藜蘆醇對TNF-a影響細胞周期的干預作用。(三)將細胞分為空白對照組、TNF-a刺激組及白藜蘆醇干預組(10-8~10-4 mol/LRes+10ng/mlTNF-a)作用4天,MMT法檢測細胞的增殖活力,觀察TNF-a對細胞增殖活力的影響及白藜蘆醇的干預作用。
14、 結果: 1.0.2%Ⅰ型膠原酶和0.2%Ⅱ型膠原酶混合能充分裂解動脈血管,細胞受損傷輕,接種成功率高;一周左右細胞就能生長到進行細胞傳代的亞融合狀態(tài)。再次進行傳代的時間大約是3~5天。傳代后大約90%的細胞可重新貼壁生長。傳代后的細胞更多的表現(xiàn)為“峰-谷”樣生長方式;第3代爬片SMC的免疫組化顯示血管平滑肌的純度可達到96%以上。 2.在不同時間段內TNT-a對血管平滑肌細胞表達PAPP-AmRNA的影響:血管平滑肌細
15、胞在1h時PAPP-AmRNA即有顯著增加(P<0.01),在8小時PAPP-AmRNA表達量達到高峰,并與各組間亦有顯著差異(P<0.01)。 3.不同濃度的TNT-a對血管平滑肌細胞表達PAPP-AmRNA表達的影響:基礎狀態(tài)下,血管平滑肌細胞PAPP-AmRNA無明顯表達,在10-1ng/mL時PAPP-AmRNA顯著表達(P=0.016),并呈劑量依賴性表達增加,并在10ng/ml達到高峰,組間比亦有顯著差異(P<0.0
16、1)。 4.白藜蘆醇對TNT-a影響平滑肌細胞PAPP-AmRNA表達的干預實驗:在10-8mol/L濃度時對TNT-a誘導的血管平滑肌PAPP-A的表達無顯著影響(P=0.148),在10-6、10-4mol/L濃度范圍內,白藜蘆醇濃度依賴性的顯著抑制TNT-a誘導的血管平滑肌PAPP-AmRNA的表達(P<0.01)。 5.不同濃度的TNT-a對血管平滑肌細胞周期的作用:10-1ng/mL濃度的TNF-a對細胞周期無
17、顯著影響,與空白組比較(P>0.05);在100~102ng/mL的濃度范圍內TNT-a使細胞S期、G2/M期數目百分比增加,G0/G1期數目百分比降低,與空白組比較有顯著性差異(P<0.01),并在TNT-a10ng/mL時達到最高。 結論: 1.復合膠原酶解離法進行大鼠胸主動脈平滑肌細胞的原代培養(yǎng)是一種簡單,高純度的原代細胞培養(yǎng)方法。 2. TNF-a呈時間、濃度依賴性的刺激血管平滑肌細胞PAPP-AmRNA
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