ERK2及IL-10在播散性念珠菌病小鼠腎臟中的表達及意義.pdf

1、目的：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是絲裂源活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的家族成員之一，參與介導細胞生長，發(fā)育，分化，凋亡等一系列生理過程。國外文獻報導，已通過小鼠模型證實ERK轉(zhuǎn)導通路是細胞免疫調(diào)節(jié)的核心通路。國內(nèi)研究證實，ERK可誘導TH2分化，ERK在免疫調(diào)節(jié)機制中起著至關重要的作用。目前有關ERK與疾病的關系的研究已在腫瘤、糖尿病腎病、艾滋病等領域開展，但目前國內(nèi)外尚缺少有關ERK通路在播散性念珠菌病腎臟中的表達的報導。<

2、br>　　IL-10是TH2細胞分泌的一種細胞因子，是天然免疫反應中重要的負調(diào)節(jié)因子。近年來，天然免疫和特異性免疫在播散性念珠菌病的發(fā)病中的作用日益受到人們的重視。
　　本研究通過建立播散性白念珠菌病感染小鼠動物模型，采用免疫組織化學染色方法來檢測不同感染時間ERK2和IL-10在小鼠腎臟的表達情況并同時對二者在本疾病中的表達情況進行相關性研究，探討其在播散性念珠菌病中可能的發(fā)病機制，為臨床治療播散性念珠菌病提供新的思路和方法。<

3、br>　　方法：
　　1菌株白念珠菌來源于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚性病科真菌室保存菌種。
　　2播散性念珠菌病小鼠模型的建立昆明小鼠90只，雌雄各半，體重25g左右，購買于河北醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心。適應環(huán)境后，按體重隨機分為A、B、C三組，每組各30只。A組小鼠為實驗組：于第1天經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺200mg/kg·d，連續(xù)4天，第5天時，經(jīng)腹腔注射濃度為1～5×106cfu/ml白念珠菌菌懸液1ml/只，共1天，B組為環(huán)磷酰

4、胺對照組：于第1天經(jīng)腹腔注射同等量環(huán)磷酰胺，連續(xù)4天，第5天再經(jīng)腹腔注射生理鹽水1ml/只，共1天；C組為空白對照組：于第1天開始經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)5天。于實驗第6d、第9d、第20d分批斷頸處死小鼠，并觀察腹腔臟器大體情況。
　　3播散性念珠菌感染小鼠腎臟念珠菌的分離、鑒定無菌條件下取出小鼠腎臟，無菌生理鹽水沖洗數(shù)次后，將小鼠一側1/2腎組織研磨后，接種于沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
　　4組織病理學檢查及免疫組化另一部分

5、腎組織用10%福爾馬林溶液固定，做常規(guī)病理HE染色及PAS染色觀察小鼠腎臟組織病理變化及白念珠菌感染情況。采用免疫組織化學鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)檢測ERK2和IL-10的表達情況。
　　結果：
　　1播散性念珠菌感染小鼠模型的建立實驗過程中，小鼠由于免疫抑制劑環(huán)磷酰胺造成多臟器出血、水腫死亡共10只；由白念珠菌播散感染死亡共11只；不明原因死亡共15只。最終，納入實驗小鼠共54只。A組小鼠實驗第6d，經(jīng)解

6、剖小鼠腹腔內(nèi)部分臟器水腫明顯，未見白色膿點形成；實驗第9d，經(jīng)解剖腹腔內(nèi)各臟器均可見大量白色膿點生成；第20d，解剖小鼠腹腔內(nèi)各臟器均可見大量白色膿點生成，部分臟器充血、壞死。B組小鼠于實驗第6d，經(jīng)解剖腹腔內(nèi)臟器部分水腫、充血；實驗第9d經(jīng)解剖后，腹腔內(nèi)臟器部分水腫、充血、壞死，無白色膿點形成；實驗第20d，小鼠體重較前有所增加，精神、食欲稍差，毛發(fā)光澤恢復，活動正常，經(jīng)解剖后，可見脾臟腫大明顯，肝臟稍充血，腎臟水腫。C組小鼠精神、食

7、欲無變化，毛發(fā)光澤好，活動正常。在實驗第6d、第9d、第20d經(jīng)解剖后，腹腔內(nèi)臟器均呈正常表現(xiàn)。
　　2播散性念珠菌感染小鼠體內(nèi)腎臟白念珠菌的分離、鑒定實驗組小鼠腎臟第6d、第9d、第20d在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)72小時，均可見白色菌落生長，經(jīng)血清培養(yǎng)法鑒定為白念珠菌。
　　3病理組織學檢查 A組小鼠，實驗第6d，鏡下可見正常腎小管和腎小球結構，腎小管胞漿紅染變性；第9d，鏡下可見腎小管細胞核固縮，胞漿紅染，出現(xiàn)退行性改變，PA

8、S染色可見紫紅色菌絲；第20d，可見腎小管部分壞死，核固縮，胞漿紅染，PAS染色腎小管和腎間質(zhì)內(nèi)可見紫紅色菌絲；B組小鼠，實驗第6d、第9d及第20d，鏡下可見正常腎小管和腎小球結構，腎小管胞漿紅染變性。C組小鼠鏡下均呈正常表現(xiàn)。
　　ERK2蛋白水平表達情況：ERK主要在胞漿中表達，陽性細胞可見胞漿染成棕黃色；免疫組化染色結果顯示，A、B、C組均可見陽性細胞表達。在A組中實驗第6d、第9d、第20d OD值分別為0.1882±0

9、.0134，0.1962±0.0098，0.1878±0.0094；表達趨勢為先升高后下降，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。B組中實驗第6d、第9d、第20d OD值分別為0.1939±0.0165，0.1900±0.0250，0.1892±0.0173；表達趨勢為表達逐漸下降，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。C組中實驗第6d、第9d、第20d OD值分別為0.1985±0.0129，0.1891±0.0124，0.2023±0.015

10、6。表達趨勢為先下降再升高，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第6d，A、B、C三組OD值分別為0.1882±0.0134，0.1939±0.0165，0.1985±0.0129，表達趨勢為表達逐漸升高，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第9d，A、B、C三組OD值分別為0.1962±0.0098，0.1900±0.0250，0.1891±0.0124，表達趨勢為表達逐漸降低，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第20d，A、B、C

11、三組OD值分別為0.1878±0.0094，0.1892±0.0173，0.2023±0.0156，表達趨勢為表達逐漸升高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，進一步兩兩比較，A組與C組比較，B組與C組比較，P<0.05，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　IL-10蛋白水平表達情況：IL-10主要在細胞漿中表達，陽性細胞可見胞漿染成棕黃色；免疫組化染色結果顯示，A、B、C組均可見陽性細胞表達，在A組中實驗第6d、第9d、第20d OD值分別為

12、0.1960±0.0355，0.2084±0.0162，0.2246±0.0361；表達趨勢為表達逐漸增高，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。B組中實驗第6d、第9d、第20d OD值分別為0.1871±0.0159，0.1978±0.0149，0.2031±0.0256表達趨勢為表達逐漸升高，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。C組中實驗第6d、第9d、第20d OD值分別為0.2387±0.0430，0.2023±0.0209，0.194

13、3±0.0167表達趨勢為表達逐漸下降，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第6d，A、B、C三組OD值分別為0.1960±0.0355，0.1871±0.0159，0.2387±0.0430，表達趨勢為先下降再升高，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第9d，A、B、C三組OD值分別為0.2084±0.0162，0.1978±0.0149，0.2023±0.0209，表達趨勢為先下降再升高，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。實驗第20d

14、，A、B、C三組OD值分別為0.2246±0.0361，0.2031±0.0256，0.1943±0.0167，表達趨勢為表達逐漸降低，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　ERK2總體重復測量計數(shù)：同組不同時間的比較F=0.092，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義；相同時間不同組的比較F=0.381，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　IL-10總體重復測量計數(shù)：同組不同時間的比較F=0.132，P>0.05，差異無統(tǒng)計學

15、意義；相同時間不同組的比較F=1.660，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。
　　ERK2與IL-10表達結果的相關性實驗組在第6天ERK2及IL-10表達的OD值結果經(jīng)直線相關分析r值為-0.829，P<0.05表達呈直線負相關。第9天及第20天，ERK2及IL-10表達的OD值結果經(jīng)直線相關分析，r值分別為-0.799，0.077，P>0.05，二者表達無相關性。
　　結論：
　　1與正常對照組比較，ERK2在播散性