播散性念珠菌病小鼠腎臟中HSP90及TLR4表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、目的:播散性念珠菌病發(fā)病與機(jī)體的天然免疫和特異性免疫有關(guān)。尤其是天然免疫在發(fā)病中的作用越來越受到重視。TLRs是宿主識(shí)別各種病原體相關(guān)分子模式，并激活和調(diào)節(jié)天然免疫-適應(yīng)性免疫反應(yīng)的一類模式識(shí)別受體。白念珠菌表面的特征性糖磷脂甘露聚糖可被TLR4識(shí)別，通過誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的釋放及促進(jìn)中性粒細(xì)胞的聚集等來介導(dǎo)宿主的抗真菌免疫反應(yīng)。熱休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中

2、的蛋白質(zhì)，加熱、缺氧、感染、氧化劑等刺激因素都可誘導(dǎo)其表達(dá)增加。HSP除參與機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)外，還參與機(jī)體的天然免疫過程。HSP90是近年來研究與白念珠菌感染密切相關(guān)的一類分子。有研究顯示HSP細(xì)胞因子的效應(yīng)是通過TLR2和TLR4信號(hào)途徑，導(dǎo)致NF-KB因子和MAPK激酶的激活實(shí)現(xiàn)的。本研究通過建立播散性念珠菌病感染小鼠動(dòng)物模型，探討HSP90及TLR4在播散性念珠菌病小鼠腎臟的表達(dá)及HSP90及TLR4表達(dá)的相關(guān)性，探討其在播散性

3、念珠菌病發(fā)病的免疫機(jī)制，為免疫及生物治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)菌株白念珠菌，來源于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科真菌檢查室保存菌種。
　　 2.建立播散性念珠菌病小鼠模型
　　 昆明小鼠90只，清潔級(jí)，雌雄各半，5～6周齡，20～259，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。經(jīng)過適應(yīng)環(huán)境，按體重隨機(jī)分成A、B、C三組，每組小鼠各30只。A組為實(shí)驗(yàn)組:在實(shí)驗(yàn)的第1天通過腹腔注射200mg/k

4、g·d環(huán)磷酰胺，連續(xù)4天，第5天時(shí)，經(jīng)腹腔注射白念珠菌菌懸液0.2mL/只，菌懸液的濃度是1～5×106cfu/mL，共1天。B組環(huán)磷酰胺對(duì)照組:在實(shí)驗(yàn)的第1天經(jīng)腹腔連續(xù)4天注射同等量的環(huán)磷酰胺，第5天時(shí)，經(jīng)腹腔注射生理鹽水0.2mL/只，共1天。C組空白對(duì)照組:在實(shí)驗(yàn)第1天經(jīng)腹腔連續(xù)5天注入同等量的生理鹽水。分別于實(shí)驗(yàn)第6天、第9天、第20天分三批處死小鼠，觀察小鼠腹腔內(nèi)部臟器大體情況。
　　 3.鑒定播散性念珠菌感染小鼠腎臟

5、菌株
　　 無菌條件下解剖小鼠取出腎臟，用無菌生理鹽水沖洗腎臟組織數(shù)次，將小鼠1/2腎臟組織研磨，在沙氏培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)。
　　 4組織病理學(xué)檢查和免疫組化檢測
　　 剩余腎臟組織用10％福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)病理HE染色和PAS染色，觀察小鼠腎組織白念珠菌感染情況和病理變化。運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法（鏈霉菌抗生素蛋白——過氧化物酶連接法SP）檢測HSP90和TLR4的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　

6、1.建立播散性念珠菌病感染小鼠模型
　　 實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠由于注射環(huán)磷酰胺免疫抑制劑造成多個(gè)臟器水腫、出血共死亡11只;由于白念珠菌播散感染共死亡12只;不明原因共死亡13只。最后，納入實(shí)驗(yàn)的總計(jì)54只小鼠。A組小鼠在實(shí)驗(yàn)第6d，飲食和精神稍差，毛發(fā)沒有光澤，呼吸正常。解剖小鼠見腹腔內(nèi)部分臟器明顯水腫，未見白色膿點(diǎn)形成;實(shí)驗(yàn)第9d，解剖小鼠見腹腔內(nèi)各臟器白色膿點(diǎn)形成;實(shí)驗(yàn)第20d，解剖小鼠見腹腔內(nèi)各臟器大量白色膿點(diǎn)形成，部分臟器

7、充血和壞死。B組小鼠在實(shí)驗(yàn)的第6d，食欲和精神稍差，毛發(fā)沒有光澤，呼吸、活動(dòng)正常。解剖小鼠見腹腔內(nèi)部臟器部分充血和水腫;實(shí)驗(yàn)第9d，解剖小鼠見腹腔內(nèi)臟器充血、水腫、壞死、沒有白色膿點(diǎn)形成;實(shí)驗(yàn)第20d，解剖小鼠見脾臟明顯腫大，肝臟略充血，腎臟稍水腫。C組小鼠飲食和精神佳，毛發(fā)光澤、無雜亂，呼吸、活動(dòng)好，于實(shí)驗(yàn)第6d、9d、20d解剖小鼠，腹腔內(nèi)部臟器都表現(xiàn)正常。
　　 2.播散性念珠菌感染小鼠腎臟組織真菌的培養(yǎng)和鑒定
　　

8、 將A組小鼠第6d、9d、20d的腎臟組織接種于沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h后，可見白色菌落生長，通過血清培養(yǎng)法和厚膜孢子瓊脂培養(yǎng)基鑒定為白念珠菌。
　　 3.組織病理學(xué)觀察
　　 A組小鼠，實(shí)驗(yàn)第6d，鏡下可見完整腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)，PAS染色未見紫紅色孢子、菌絲;實(shí)驗(yàn)第9d，鏡下可見腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核固縮，PAS染色見紫紅色孢子、菌絲;實(shí)驗(yàn)第20d，腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)消失，壞死形成，PAS染色見大量紫紅色孢子

9、、菌絲;B組小鼠，實(shí)驗(yàn)第6d，9d及20d，腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)完整，部分細(xì)胞變性，胞漿均質(zhì)紅染，細(xì)胞核完整;C組小鼠顯微鏡下均呈正常表現(xiàn)。
　　 4.TLR4在蛋白水平表達(dá)情況
　　 運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠腎臟中的TLR4主要在細(xì)胞胞膜中表達(dá)，陽性細(xì)胞可見胞膜上有棕黃色顆粒沉積。免疫組化染色結(jié)果顯示，A、B、C三組都顯示陽性細(xì)胞表達(dá)。A組:第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1935±0.2019、0.2183

10、±0.0369、0.1991±0.3083，表達(dá)呈先上升后下降趨勢，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組:第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1980±0.0290、0.2107±0.0240、0.2100±0.0288，表達(dá)呈先上升后下降趨勢，P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組:第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1834±0.0182、0.2017±0.0258、0.1962±0.0232，表達(dá)呈先上升后下降趨勢，P＜0

11、.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)第6d，A、B、C三組OD值分別為0.1935±0.2019、0.1980±0.0290、0.1834±0.0182，實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組表達(dá)升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)第9d，A、B、C三組OD值分別為0.2183±0.0369、0.2107±0.0240、0.2017±0.0258，實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組表達(dá)升高，P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)第20d，A、B、C三組OD值分別為0.19

12、91±0.3083、0.2100±0.0288、0.1962±0.0232，實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組表達(dá)升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料方差分析，其中各組在不同時(shí)間點(diǎn)之間存在差別，F(xiàn)=8.093，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)行總體比較不同組間不存在差別F=3.595，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.HSP90在蛋白水平中表達(dá)情況
　　 運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠腎臟中HSP90主要

13、表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，陽性細(xì)胞可見胞漿上有棕黃色顆粒沉積;免疫組化結(jié)果顯示，A、B、C三組都顯示陽性細(xì)胞表達(dá)。A組:實(shí)驗(yàn)第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1851±0.0201、0.2155±0.0345、0.1894±0.0266，表達(dá)先上升后下降趨勢，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B組:實(shí)驗(yàn)第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1769±0.0183、0.1961±0.0234、0.1924±0.0310，表達(dá)先上升后下降趨勢

14、，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;C組:實(shí)驗(yàn)第6d、第9d、第20dOD值分別為0.1825±0.0300、0.1945±0.0345、0.1925±0.0351，表達(dá)先上升后下降趨勢，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)第6d，A、B、C組OD值分別為0.1851±0.0201、0.1769±0.0183、0.1825±0.0300，實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組表達(dá)升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)第9d，A、B、C三組OD值分別為0.

15、2155±0.0345、0.1961±0.0234、0.1945±0.0345，實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組表達(dá)升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)第20d，A、B、C三組OD值分別為0.1925±0.0351、0.1924±0.0310、0.1894±0.0266,實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組表達(dá)升高，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過重復(fù)測量資料設(shè)計(jì)方差分析，各組在不同時(shí)間點(diǎn)之間存在差別，F(xiàn)=8.375，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行總體

16、比較不同組間不存在差別，F(xiàn)=0.914，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.TLR4與HSP90的相關(guān)性結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)組HLR4與HSP90表達(dá)的OD值通過曲線擬合，實(shí)驗(yàn)第6d得到r=0.002，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明二者無明顯相關(guān);實(shí)驗(yàn)第9d得到，r=0.000，P＞0.05，說明二者無明顯相關(guān);實(shí)驗(yàn)第20d得到，r=0.081，P＞0.05，說明二者無明顯相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　

17、　 1.TLR4在播散性念珠菌病小鼠腎臟組織中的表達(dá)，在感染早期呈現(xiàn)上升趨勢，到晚期呈現(xiàn)下降趨勢。
　　 2.HSP90在播散性念珠菌病小鼠腎臟組織中的表達(dá)，在感染早期呈現(xiàn)上升趨勢，到晚期呈現(xiàn)下降趨勢。
　　 3.TLR4與HSP90的表達(dá)在感染晚期都呈現(xiàn)下降趨勢，有可能是造成白念珠菌侵襲性感染腎臟的病因之一。
　　 4.TLR4和HSP90在播散性念珠菌病小鼠腎臟組織的表達(dá)比在正常小鼠腎臟表達(dá)升高。