內源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸對擬南芥生理影響及植物XB3-like蛋白家族功能研究.pdf

1、植物的固著性使它整個生命過程中不可避免面臨各種不利的外部環(huán)境（如干旱脅迫、鹽脅迫、澇害、高溫、低溫、病原菌侵襲等）。在長期的進化過程中，植物形成了一套響應脅迫和提高抗性的機制。因此，理解植物應答逆境脅迫傷害、適應性變化等諸多生理過程，對提高農作物的產量和品質有重要意義。內源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸對擬南芥生理影響
　　 VLCPUFAs(very long chain polyunsaturated fatty acids)對

2、人體營養(yǎng)和健康非常重要。雖然人體自身能夠合成VLCP(UFAs，但其效率極低。目前，該類脂肪酸的主要來源是深海魚油，其主要有效成分是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。但由于過度捕撈、環(huán)境污染等諸多原因，導致魚油的供給已遠不能滿足市場需求。隨著植物轉基因技術的發(fā)展，許多生產超長鏈多不飽和脂肪酸的轉基因油料作物已誕生，如油菜，大豆和亞麻等。因此，研究這些異源脂肪酸在植物生理和對非生物脅迫的耐受性具有可行性。該研究將為轉基因植

3、物中商業(yè)化生產超長連多不飽和脂肪酸奠定理論基礎。
　　 我們以內源合成二十碳二烯酸(EDA)和二十碳三烯酸(ETrA)的轉IgASE1基因的擬南芥作為材料，結合外源添加實驗，研究EDA和ETrA對擬南芥的生理表型及干旱脅迫的耐受性的影響。主要研究結果總結如下:
　　 (1) RT-PCR分析表明，IgASE1基因在轉基因擬南芥中表達;氣相色譜分析其葉片脂肪酸組成，結果表明:內源合成的EDA和ETrA占總脂肪酸含量的25.

4、6mol％;葉片膜脂組成分析表明，EDA和ETrA參與了生物膜脂的構成，從而將膜脂內不飽和脂肪酸的含量由野生型的59.6mol％，增加到轉基因植株中73.7mol％。
　　 (2)連續(xù)多代擬南芥生長表型調查結果表明，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥表型上有差異:苗期生長緩慢，花較小且花瓣較薄，種子更飽滿，后熟時間縮短。
　　 (3)外源添加ABA實驗結果顯示，與野生型擬南芥相比轉基因擬南芥在種子萌發(fā)，苗期生長及氣孔的張開

5、方面對ABA的敏感性增強。
　　 (4)選用萌發(fā)后3天的幼苗和萌發(fā)后3周的苗子分別進行模擬干旱和斷水處理實驗，結果表明轉基因擬南芥比野生型擬南芥對干旱的耐受能力強。利用qRT-PCR分析依賴于ABA途徑的關鍵基因（RD29B、RD26和CBF3）和非依賴于ABA途徑的關鍵基因（COR15A、ADH1和CBF2）的表達情況，結果表明轉基因擬南芥對干旱的強耐受力來源于依賴ABA途徑和非依賴ABA途徑的共同作用。
　　 (5)

6、外源添加EDA和ETrA可以在野生型中模擬轉基因擬南芥對ABA敏感和對干旱耐受的表型，即EDA和ETrA在擬南芥對ABA和干旱的響應過程中作用。植物XB3-like蛋白家族功能研究
　　 具有同源性結構域及序列，進化上相關的蛋白質歸在同一個蛋白家族，對蛋白家族的分析研究有利于對該蛋白家族的功能及進化進行系統(tǒng)研究。隨著基因組測序的飛速發(fā)展，至今已有五十多種植物完成或正在進行全基因組測序，這為在多個物種中分析比對一個蛋白家族提供可行

7、性。
　　 水稻XB3，是XA21絲氨酸/蘇氨酸激酶的底物，在XA21介導的抗病途徑中起到重要作用。在擬南芥中同源基因有5個，分別命名為XBAT31、XBAT32、XBA T33、XBAT34和XBAT35。對XBAT32和XBAT35的研究發(fā)現(xiàn)，它們在植物的生長發(fā)育及抗逆過程中起到重要作用。經過我們對這些蛋白結構分析發(fā)現(xiàn)，它們都包括錨定重復序列(ANK)和保守的C3HC4型指環(huán)結構。因此，我們將同時含有ANK和C3HC4指環(huán)結

8、構的蛋白歸為一個蛋白家族，并命名為XB3-like蛋白家族。本研究利用生物信息學的方法分析比對數(shù)據(jù)庫提供的所有物種序列(29種)，對該蛋白家族的功能及進化進行系統(tǒng)研究，以期找到具有合適功能的基因用于生產實踐。
　　 (1)我們利用生物信息學方法從己公布的29種全基因組測序的物種中搜索到187個同時具有ANK和C3HC4型指環(huán)結構的蛋白。因其與XB3結構上相似，我們命名為XB3-like蛋白家族，編碼這組蛋白的基因命名為XB3-l

9、ike基因家族。對29個物種中XB3-like基因的數(shù)量統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，兩種藻中無XB3-like基因，結果說明該蛋白家族在植物進化過程中可能是由蕨類開始出現(xiàn)的。
　　 (2)根據(jù)XB3-like蛋白間的同源性關系構建進化樹，發(fā)現(xiàn)該家族蛋白可分為三組，且三組蛋白的指環(huán)結構域之間存在明顯差異。另外，我們還發(fā)現(xiàn)多數(shù)植物中XB3-like蛋白分別屬于上述三組蛋白，而蓖麻和苜蓿中僅有2個XB3-like蛋白且都屬于第Ⅰ組。
　　 (

10、3)對模式植物擬南芥和三種作物（水稻、玉米和大豆）的芯片分析結果顯示，該基因家族在植物的整個生命周期和不同的組織中均有廣泛表達和偏好性表達，這個結果說明該家族基因可能在植物不同發(fā)育階段和不同組織發(fā)揮重要的生物學功能。
　　 (4)我們利用熒光定量的方法檢測到擬南芥和玉米中多個XB3-like基因的表達受激素和非生物脅迫信號的影響，預示著它們可能在植物生長發(fā)育以及脅迫響應過程中扮演了重要角色。
　　 (5)擬南芥XBAT3

11、1表達受多種激素和非生物脅迫信號的誘導。于是我們對XBAT31基因的功能產生興趣。我們將基因上游2Kb啟動子序列與GUS報告基因連接后表達，發(fā)現(xiàn)XBAT31在不同組織均有表達，其中莖、葉及花序中表達量較高。
　　 (6) XBAT31基因低量表達突變體在萌發(fā)期和苗生長早期對鹽脅迫耐受性較野生型擬南芥低。其中，突變體內非依賴ABA途徑內的基因表達量明顯降低，可能是使突變體在萌發(fā)期和苗期對鹽脅迫的耐受性降低的原因。因此，我們推測XB