花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途徑的構(gòu)建及大豆種子特異性啟動(dòng)子的改造.pdf

1、多不飽脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，尤其是超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(Very long chain polyunsaturated fatty acids，VLC-PUFAs)，具有十分重要的生理功能，是維持人體健康所必需的。通常情況下PUFAs主要來(lái)源于深海魚油和海洋藻類，但是由于過(guò)度捕撈，海洋污染以及藻類生產(chǎn)PUFAs價(jià)格的昂貴，因此迫切需要尋找一種PUFAs的替代來(lái)源。
　　 隨

2、著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因的油料作物生產(chǎn)PUFAs被認(rèn)為是一種十分有前景的的替代來(lái)源。大豆是最主要的油料作物之一，含有非常豐富的亞油酸(Linoleic acid，LA)和α-亞麻酸(α-Linolenic acid，ALA)，它們分別占大豆中總脂肪酸的55％和13％，是合成花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)的前體。因此，大豆是通過(guò)代謝工程生

3、產(chǎn)ARA和EPA的重要宿主。在轉(zhuǎn)基因植物中，ARA和EPA生物合成的A6途徑已經(jīng)被廣泛研究了，但△8途徑僅在擬南芥中進(jìn)行研究并且不是種子特異性表達(dá)。由于在轉(zhuǎn)基因植物中ARA和EPA生物合成的△6途徑存在復(fù)雜的底物轉(zhuǎn)換瓶頸，因此，在本研究中，我們分別在釀酒酵母和大豆中重構(gòu)ARA和EPA生物合成的△8途徑，構(gòu)建出產(chǎn)ARA和EPA的釀酒酵母工程菌和無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因大豆；同時(shí)對(duì)BCSP952啟動(dòng)子進(jìn)行改造，以便提高轉(zhuǎn)基因大豆中ARA和EP

4、A的合成效率。
　　 首先，分別從球等鞭金藻H29(Isochrysis galbana H29)、小眼蟲藻FH277(Euglena gracilis FH277)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中克隆出△8途徑中的三個(gè)基因△9延長(zhǎng)酶基因IgASE2、A8脫氫酶基因efd2和△5脫氫酶基因ptd5，并在釀酒酵母INVSc1中鑒定它們的功能。IgASE2基因長(zhǎng)1653 bp，包括一個(gè)786 bp

5、的ORF(Open reading frame)、一個(gè)44 bp的5'-UTR(Untranslatedregion)和一個(gè)823 bp3’-UTR。該基因編碼的延長(zhǎng)酶IgASE2與已經(jīng)報(bào)道的延長(zhǎng)酶IgASE1的氨基酸序列有87％的相似性。IgASE2在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)，能分別將LA和ALA轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸(ω6-eicosadienoic acid，EDA)和二十碳三烯酸(ω3-eicosatrienoic acid，EtrA)，L

6、A和ALA的轉(zhuǎn)化率分別是57.6％和56.1％，表明IgASE2基因是一個(gè)新的C18-△9專一性的PUFAs延長(zhǎng)酶基因。efd2基因ORF長(zhǎng)1266 bp，編碼421個(gè)氨基酸，它與已經(jīng)報(bào)道的EFD1的氨基酸序列相似性為96％。efd2基因在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)，催化底物EDA和EtrA轉(zhuǎn)化成二高γ-亞麻酸(dihomo-γ-linolenic acid，DGLA)和二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid，ETA)的轉(zhuǎn)化效率

7、分別約為31.2％和46.3％，表明efd2是一個(gè)位置專一性的A8脫氫酶基因。ptd5基因ORF長(zhǎng)1410 bp，編碼469個(gè)氨基酸。它在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)，催化DGLA和ETA生成ARA和EPA的效率分別約28.7％和37.2％，表明ptd5是一個(gè)位置專一性的A5脫氫酶基因。
　　 然后，利用克隆的IgASE2、efd2和ptd5基因，分別在釀酒酵母和大豆中構(gòu)建了ARA和EPA生物合成的A8(ω6-△8，ω3-△8)途徑，獲得了

8、產(chǎn)ARA和EPA的釀酒酵母工程菌和無(wú)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因大豆。根據(jù)ARA和EPA生物合成的△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑，將該途徑中所需要的三個(gè)目的基因IgASE2、efd2和ptd5的表達(dá)盒有機(jī)集合在一起，構(gòu)建成釀酒酵母共表達(dá)載體pYAE5。將該表達(dá)載體pYAE5轉(zhuǎn)化至釀酒酵母INVScl，構(gòu)建成釀酒酵母工程菌YAE985。該菌在添加外源底物L(fēng)A和ALA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)后，產(chǎn)生的ARA和EPA分別占總脂肪酸含量的1.6％和2

9、.5％，LA轉(zhuǎn)化成ARA以及ALA轉(zhuǎn)化成EPA的最終轉(zhuǎn)化率分別是10.1％和16.9％。這些結(jié)果表明，在釀酒酵母中成功地構(gòu)建了ARA和EPA生物合成的△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑。
　　 利用RT-PCR(Real Time PCR)對(duì)工程菌YAE985的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明：工程菌連續(xù)轉(zhuǎn)接20次后，IgASE2、efd2和ptd5基因在轉(zhuǎn)錄水平仍然保持1:1:1的關(guān)系，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生遺傳重組和目的基因部分丟失的情

10、況，因此釀酒酵母工程菌YAE985具有很好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 用大豆種子特異性啟動(dòng)子BCSP952分別構(gòu)建基因IgASE2、efd2和ptd5的表達(dá)盒，并克隆進(jìn)表達(dá)載體pBX，構(gòu)建成通過(guò)△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑生物合成ARA和EPA的無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大豆的表達(dá)載體pX9AE5。用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行大豆轉(zhuǎn)化，篩選出含有△8(ω6-△8，ω3-△8)生物合成途徑的轉(zhuǎn)基因大豆。然后對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行雌二醇誘導(dǎo)，進(jìn)一步

11、篩選出無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因大豆。轉(zhuǎn)基因大豆種子中ARA和EPA的含量分別占總脂肪酸含量的6.8％和3.6％。這些結(jié)果表明，在無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因大豆中成功地構(gòu)建了ARA和EPA生物合成的△8(ω6-△8，ω3-△8)途徑。
　　 最后，為了提高轉(zhuǎn)基因大豆中ARA和EPA的合成水平，本文對(duì)BCSP952進(jìn)行了功能分析。在此基礎(chǔ)上，對(duì)BCSP952進(jìn)行改造，以提高BCSP952的強(qiáng)度。為了分析BCSP952的功能，分別構(gòu)建了BCSP95

12、2的5'-端缺失啟動(dòng)子片段BCSP666、BCSP471、BCSP285和BCSP156。將它們連接到pBI121質(zhì)粒的GUS基因上游后轉(zhuǎn)化擬南芥并通過(guò)GUS組化檢測(cè)和GUS酶活性測(cè)定來(lái)鑒定這些啟動(dòng)子的功能。結(jié)果表明：BCSP666的活性與BCSP952活性基本相同，達(dá)到BCSP952活性的96.5％；BCSP471的活性次之，約為BCSP952活性的69.4％；BCSP285和BCSPl56的活性相對(duì)較低，僅為BCSP952活性的15

13、.5％和10.1％：除BCSP156片段外，其余5’-端缺失啟動(dòng)子片段都具有種子特異性。說(shuō)明：種子特異性元件的種類和數(shù)量直接影響啟動(dòng)子的強(qiáng)度；并且，在BCSP952啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至上游約-594位這個(gè)區(qū)段內(nèi)，種子特異性啟動(dòng)子元件的數(shù)量越多，啟動(dòng)子的活性越強(qiáng)，但是超過(guò)這個(gè)區(qū)域，增加這些元件的數(shù)量，并不能有效增加啟動(dòng)子的強(qiáng)度。
　　 為了提高BCSP952的強(qiáng)度，通過(guò)在BCSP952啟動(dòng)子的-140位插入ABRE和Sph元件，

14、構(gòu)建成啟動(dòng)子BCSP952-aa、BCSP952-as和BCSP952-ss，并將它們轉(zhuǎn)化至擬南芥中進(jìn)行功能鑒定。GUS組化檢測(cè)和GUS活性測(cè)定表明：GUS基因只在種子中表達(dá)，說(shuō)明改造后的啟動(dòng)子是種子特異性的啟動(dòng)子；BCSP952-as控制的GUS活性最高，約為BCSP952的180％、BCSP952-aa控制的GUS活性次之，約為BCSP952的112％、BCSP952-ss控制的GUS活性反而降低，約為BCSP952的88％。然后，

15、從每種類型的啟動(dòng)子中選擇GUS活性最高的4個(gè)株系進(jìn)行southern雜交和RT-PCR分析。Southern雜交表明，含有BCSP952-ss的一個(gè)株系的GUS基因是雙拷貝，其余啟動(dòng)子的株系中GUS基因都是單拷貝。RT-PCR分析表明：BCSP952-as控制的GUS基因轉(zhuǎn)錄水平最高，BCSP952-aa次之，BCSP952-ss最低，這與測(cè)定的GUS活性是一致的。這些結(jié)果說(shuō)明：通過(guò)對(duì)BCSP952進(jìn)行改造，提高了BCSP952的強(qiáng)度；