砂生槐種子生物堿抗包蟲效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　包蟲病是主要由棘球蚴或泡球蚴寄生于人體或動(dòng)物體內(nèi)引起的人獸共患寄生蟲病，在全球廣泛流行，嚴(yán)重危害人類健康和生命安全。目前，治療包蟲病以手術(shù)為主，但無法耐受手術(shù)或病情復(fù)雜而無法進(jìn)行手術(shù)的患者，只能依賴藥物治療，而獲批臨床使用的藥物僅有阿苯達(dá)唑和甲苯達(dá)唑兩種，品種單一，療效不理想，并且發(fā)現(xiàn)副作用多而嚴(yán)重，耐藥現(xiàn)象日益增多。因此，亟需研發(fā)療效明確、副作用小的抗包蟲藥物。從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的數(shù)千年治療蟲病的經(jīng)驗(yàn)中尋找線索，是發(fā)

2、掘抗包蟲藥物的一個(gè)重要途徑。砂生槐為青藏高原特有植物，藏醫(yī)記載其種子性苦、寒，具有治療白喉、蟲病、中毒癥、消化不良等功效。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)砂生槐種子親脂性總生物堿在體外具有殺滅細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)活性，在體內(nèi)可抑制小鼠繼發(fā)性棘球蚴生長(zhǎng)，提示砂生槐種子總堿中含有驅(qū)蟲成分。但砂生槐種子在藏醫(yī)中以水煎劑入藥，親脂性總堿水溶性差、抗蟲效果弱，因此，本課題從砂生槐種子的水溶性成分中尋找有效的抗包蟲成分并研究其抗蟲機(jī)制。
　　研究方法：<

3、br>　　以乙醇為溶劑，采用熱回流提取法分離砂生槐種子生物堿，以秀麗隱桿線蟲為模型，對(duì)砂生槐種子的分離產(chǎn)物進(jìn)行殺蟲活性篩選。采用柱層析分離法，從殺蟲活性較強(qiáng)的成分中提取極性較小的餾分和極性較大的餾分，TLC定性鑒定餾分的成分，通過秀麗隱桿線蟲確定砂生槐種子的殺蟲活性成分，并通過HPLC分析其主要化學(xué)成分。分離自然感染羊肝細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，在體外與砂生槐種子成分共同培養(yǎng)7天，觀察原頭節(jié)形態(tài)變化及存活情況，進(jìn)一步確定砂生槐種子的殺蟲活性成分

4、。
　　NIH小鼠腹腔注射細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)建立慢性棘球蚴病模型，BALB/c小鼠腹腔注射泡球蚴建立慢性泡球蚴病模型，分別于感染后20 w和14 w用砂生槐種子殺蟲活性成分灌胃治療，劑量為100 mg/kg/day，治療6 w后剖殺小鼠檢測(cè)。剝離棘球蚴囊泡組織，稱量濕重，常規(guī)HE染色；FCM分析脾臟CD3+、CD4+、CD8+和PD-1+的T細(xì)胞亞群；ELISA檢測(cè)IFN-γ和IL-4水平；CFSE染色檢測(cè)脾細(xì)胞增殖能力。以秀麗隱桿

5、線蟲為模式生物，檢測(cè)砂生槐種子殺蟲活性成分作用后秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力、生殖能力、壽命、體長(zhǎng)及ROS水平，反映其抗蟲機(jī)制。體外培養(yǎng)肝細(xì)胞株HepG-2細(xì)胞和Chang liver細(xì)胞，MTT法檢測(cè)砂生槐種子殺蟲活性成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；BALB/c小鼠口服砂生槐種子殺蟲活性成分（100 mg/kg/day）6 w后，檢測(cè)血清肝腎生化指標(biāo)和病理變化，評(píng)價(jià)砂生槐種子殺蟲活性成分的毒副作用。Ⅲ型干擾素成員IL-28B與抗原EAMMH在0、

6、3、6 w同時(shí)注射 C57BL/6小鼠，10 w分離脾細(xì)胞， FCM分析CD4+CD25+Foxp3+Treg占脾淋巴細(xì)胞比例，ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)目，間接ELISA檢測(cè)抗原特異性IgG1和IgG2c水平，反映IL-28B對(duì)Treg及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，為其應(yīng)用于包蟲病治療奠定基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果：
　　本課題從砂生槐種子獲得4種提取物：非水溶性生物堿（E1）、水溶性生物堿（E2）、水溶性非生物堿（E3

7、）和不溶性非生物堿（E4）。E1、E2、E3和 E4的殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別為31.03 mg/ml、14.29 mg/ml、29.94 mg/ml和25.64 mg/ml，E2的LC50最低。從E2中提取到極性較小的餾分E2-a和極性較大的餾分E2-b。E2-a和E2-b殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別是9.06 mg/ml和36.24 mg/ml。TLC定性鑒定，E2-a含有苦參堿和槐果堿，E2-b含有氧化苦參

8、堿和氧化槐果堿?？鄥A和槐果堿殺秀麗隱桿線蟲的24 h-LC50分別是12.03 mg/ml和9.81 mg/ml。HPLC分析100μg/ml E2-a中苦參堿和槐果堿的含量分別為42.8μg/ml和25.7μg/ml。E2-a體外作用于細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)后，蟲體出現(xiàn)皺縮、一端或兩端出現(xiàn)氣泡、吸盤變形、頂突明顯外翻等異常表現(xiàn)，活性降低。E2-b、E2、苦參堿、槐果堿在體外對(duì)原頭節(jié)活性均有不同程度影響。殺原頭節(jié)的72 h-LC50值由低到

9、高依次是E2-a（0.35 mg/ml）、E2（0.45 mg/ml）、槐果堿（0.79 mg/ml）、苦參堿（1.16 mg/ml）、E2-b（2.12 mg/ml），E2-a的LC50值最低。
　　治療小鼠慢性棘球蚴病的結(jié)果表明， E2-a組的棘球蚴囊泡組織濕重（8.40±2.93 g）明顯低于陰性對(duì)照組（11.33±1.64 g）（p=0.042）；E2-a組的囊泡生發(fā)層與角皮層部分剝離，角皮層增厚，變得疏松，出現(xiàn)大量泡狀物

10、，失去典型的紋狀結(jié)構(gòu)，與外膜之間的界限變得模糊不清；E2-a組小鼠脾臟CD3+T細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞的比例（45.14％±23.93%）高于陰性對(duì)照組（14.74%±9.39%）（p=0.011），且主要是 CD4+T細(xì)胞比例（72.28%±3.63%）高于陰性對(duì)照組（50.33%±27.92%）（p=0.036）所致，CD8+T比例無明顯升高或降低（p>0.05）；E2-a組小鼠 PD-1+T細(xì)胞比例（9.92%±6.77%）顯著低于陰性

11、對(duì)照組（25.51%±13.53%）（p=0.009），且CD4+PD-1+T細(xì)胞比例為5.73%±1.62%，明顯低于陰性對(duì)照組（12.59%±6.35%）（p=0.023），CD8+PD-1+T細(xì)胞比例為0.86%±0.35%，明顯低于陰性對(duì)照組（2.77%±1.87%）（p=0.020）；E2-a組小鼠血清IFN-γ水平無明顯變化，血清IL-4濃度平均為4.21 pg/ml，與陰性對(duì)照組（1.13 pg/ml）比較有升高

12、趨勢(shì)；E2-a組抗原刺激后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4濃度平均為5.75 pg/ml，與陰性對(duì)照組（3.10 pg/ml）比較有升高趨勢(shì)；E2-a組小鼠脾細(xì)胞增殖能力無增高。治療慢性泡球蚴病小鼠的結(jié)果表明，E2-a組小鼠的泡球蚴囊泡組織濕重為6.10±2.16 g，顯著低于陰性對(duì)照組（11.25±1.73 g）（p<0.01），平均降低囊重約5.15 g；E2-a組小鼠血清INF-γ水平無降低，IL-4濃度平均為48.46 pg/ml，較陰

13、性對(duì)照組（32.08 pg/ml）明顯升高（p=0.032）。
　　秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為能力檢測(cè)結(jié)果表明，8 mg/ml的E2-a作用24 h后，引起秀麗隱桿線蟲的身體彎曲頻率降為陰性對(duì)照組的1/3（p<0.01）；頭部擺動(dòng)頻率平均為34.5次/min，明顯低于陰性對(duì)照組（59.1次/min）（p<0.01）；咽泵頻率平均為38.9次/min，低于陰性對(duì)照組（71.4次/min）（p<0.01）。E2-a能夠抑制秀麗隱桿線蟲的排

14、卵功能，8 mg/ml的E2-a處理后的秀麗隱桿線蟲每條蟲排卵總數(shù)平均為205.2，明顯低于陰性對(duì)照（248.8/蟲）（p<0.01），在第3天和第4天的排卵量分別平均為36.8/蟲和13.2/蟲，明顯低于陰性對(duì)照組（分別為54.4/蟲和28.2/蟲）（p<0.05），但AO染色未發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞凋亡增多。8 mg/ml E2-a組線蟲的壽命為9.1±4.1天，明顯低于陰性對(duì)照組（13.0±4.6天）（p=0.021）。8 mg/ml E2

15、-a組線蟲的體長(zhǎng)平均為447.6 pixels，明顯短于陰性對(duì)照組（486.8 pixels）（p<0.01）。E2-a無誘導(dǎo)ROS水平升高的作用。
　　體外MTT實(shí)驗(yàn)證明，濃度為1 mg/ml的E2-a作用48 h后，HepG-2細(xì)胞和Chang liver細(xì)胞的抑制率分別為29.03%和38.36%，因此低濃度E2-a對(duì)肝細(xì)胞株HepG-2和Chang liver細(xì)胞的增殖有一定抑制作用。小鼠口服E2-a后檢測(cè)血清肝腎生化指標(biāo)

16、，發(fā)現(xiàn)反映肝功能的指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（38.333 U/L±4.726 U/L）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（150.000 U/L±35.763 U/L）較陰性對(duì)照組（谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶分別為33.333 U/L±7.638U/L和139.667 U/L±30.172 U/L）略升高，反映腎功能的的指標(biāo)肌酐（18.000μM/L±1.000μM/L）較陰性對(duì)照組（11.000±7.211μM/L）略升高，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余指標(biāo)無明顯升高或降低，組

17、織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肝腎細(xì)胞出現(xiàn)明顯改變。
　　包蟲感染中Treg增多，造成感染持續(xù)，故下調(diào)Treg是治療包蟲病的策略之一，本課題研究了Ⅲ型干擾素成員 IL-28B對(duì) Treg的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明， EAMMH-rAd-mIL-28B組的Treg比例為0.17%±0.17%，顯著低于非特異性對(duì)照EAMMH-rAd-EGFP（0.76%±0.25%）（p<0.05）；EAMMH-rAd-mIL-28B組小鼠分泌 IFN-γ的脾細(xì)胞數(shù)較對(duì)照

18、組無明顯升高；與 EAMMH組比較， EAMMH/rAd-mIL-28B組的IgG1水平有增高趨勢(shì)，而IgG2c水平降低（p<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　砂生槐種子生物堿中抗蟲活性較強(qiáng)的是低極性的水溶性生物堿 E2-a，其主要化學(xué)成分為苦參堿和槐果堿（68.5%）。E2-a抗包蟲的機(jī)制為損傷囊泡、誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增多、下調(diào)T細(xì)胞表面負(fù)調(diào)節(jié)分子PD-1的表達(dá)、調(diào)節(jié)IFN-γ和IL-4，促進(jìn)免疫功能。E2-a能夠影響秀麗