槐果堿抗實驗性大鼠肝纖維化作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的:肝纖維化是各種慢性肝病肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積、化學(xué)毒物、膽汁淤積以及營養(yǎng)不良等原因長期反復(fù)作用,導(dǎo)致慢性肝損傷,引發(fā)肝星狀細(xì)胞(HSC)激活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)特別是Ⅰ、Ⅲ膠原的過度合成而降解相對不足,使ECM在肝內(nèi)過多沉積引起肝纖維化。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)介導(dǎo)的信號通路在HSC激活以及ECM的產(chǎn)生中起重要作用。 臨床上有效的抗肝纖維化藥物不多,秋水仙喊、糖皮質(zhì)激

2、素、青霉胺等抗肝纖維化的藥物臨床療效不十分肯定,且嚴(yán)重副作用較多,從而限制了其在臨床的應(yīng)用。中草藥及其單體抗肝纖維化的研究一直比較活躍,迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些中草藥具有抗肝纖維化的作用,如苦參堿、丹參、柴胡等。 槐果堿是從中藥苦豆子中提取的一種苦參型生物堿。近年來,研究表明槐果堿有明顯抗柯薩奇B病毒(CVB)的作用及免疫調(diào)節(jié)功能。在體外100mg/L以上濃度時有明顯的抗SARS病毒的作用。此外,槐果堿具有抑制HepG2.2.15

3、細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制率明顯優(yōu)于拉米夫定。關(guān)于其是否具有抗肝纖維化作用未見報道。本研究主要探討槐果堿對大鼠肝纖維化模型纖維化進(jìn)程的抑制作用及可能機制。 研究方法: 1、體內(nèi)實驗：20mg/kg槐果堿干預(yù)二甲基亞硝胺(DMN)及膽總管結(jié)扎(BDL)致實驗性大鼠肝纖維化模型,三周后處死,檢測各組血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅

4、素(TB)和直接膽紅素(DB);HE染色及Masson染色評估各組肝纖維化病理進(jìn)程；堿水解法檢測肝組織中羥脯氨酸(HP)含量；免疫組化檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及I型膠原表達(dá)；RT-PCR檢測α-SMA、TGF-β1及Ⅰ型前膠原α1mRNA表達(dá)。 2、體外實驗：采用改良Fredimen法分離、培養(yǎng)大鼠HSC,抗desmin免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定HSC;RT-PCR檢測槐果堿干預(yù)大鼠原代培養(yǎng)HSCα-SMA、TGF-β1

5、及Ⅰ型前膠原α1mRNA表達(dá),免疫熒光檢驗槐果堿干預(yù)后desmin及α-SMA表達(dá)；CellCounting Kit-8(CCK-8)及5-溴,2-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)檢測槐果堿對活化大鼠HSC增殖的影響。 研究結(jié)果: 1、肝功能結(jié)果顯示DMN模型大鼠血清ALT、AST及TB水平明顯高于正常組大鼠,槐果堿干預(yù)后ALT、AST及TB明顯下降；BDL模型大鼠血清ALT、AST、TB及DB明顯高于正常組及假手術(shù)組,槐果堿

6、干預(yù)后ALT及AST明顯下降。 2、HE染色顯示槐果堿干預(yù)組與各模型組相比,肝纖維化程度明顯減輕。Masson染色顯示槐果堿干預(yù)組較各模型組纖維染色面積比明顯下降,槐果堿干預(yù)DMN組的纖維染色面積比為8.76％±0.73％,DMN模型組為19.73％±1.39％,兩組有顯著差異；槐果堿干預(yù)BDL組的纖維染色面積比為9.98％±0.71％,BDL模型組為16.45％±1.57％,兩組有顯著差異。肝組織羥脯氨酸含量結(jié)果顯示槐果堿干預(yù)

7、組較各模型組羥脯氨酸含量明顯下降,槐果堿干預(yù)DMN組肝組織羥脯氨酸含量為261.17±20.45μg/g肝濕重,DMN模型組為61.17±20.55μg/g肝濕重,兩組有顯著差異；槐果堿干預(yù)BDL組肝組織羥脯氨酸含量為163±17.03μg/g肝濕重,BDL模型組為259.33±23.18μg/g肝濕重,兩組有顯著差異。 3、槐果堿干預(yù)組肝組織中α-SMA、TGF-β1及I型前膠原α1mRNA表達(dá)較各模型組明顯降低,槐果堿干預(yù)D

8、MN組較DMN模型組上述mRNA表達(dá)分別下降31.9％、32.5％及29.3％；槐果堿干預(yù)BDL組較BDL模型組上述mRNA表達(dá)分別下降34.8％、21.8％及16.3％。槐果堿干預(yù)組α-SMA及I型膠原蛋白表達(dá)較各模型組下降。 4、分離的大鼠HSC細(xì)胞得率為5～6×107/肝,細(xì)胞存活率95％以上,細(xì)胞純度90％以上。 5、用TGF-β1(1ng/ml)處理原代培養(yǎng)的HSC,可使HSC表達(dá)α-SMA、TGF-β1及I型

9、前膠原α1mRNA量明顯升高,而用200mg/L槐果堿干預(yù)后HSC表達(dá)α-SMA,TGF-β1及I型前膠原α1的mRNA量顯著降低,且400mg/L槐果堿組mRNA表達(dá)量明顯低于200mg/L槐果堿組,提示劑量依賴效應(yīng)。200mg/L槐果堿干預(yù)72h后,HSC表達(dá)α-SMA蛋白較對照組下降。 5、400～1000 mg/L槐果堿對活化大鼠HSC增殖具有劑量、時間依賴的抑制作用。 研究結(jié)論: 1.以20mg/kg槐