β-葡聚糖抗SD大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用及其機(jī)制研究.pdf

1、β-葡聚糖抗SD大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用及其機(jī)制研究一、研究背景肝纖維化是各種慢性肝病肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積、化學(xué)毒物、肝內(nèi)膽汁淤積以及營養(yǎng)不良等原因長期反復(fù)作用，導(dǎo)致慢性肝損傷，引發(fā)以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多，降解相對不足，在肝內(nèi)過多沉積引起肝纖維化。 傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，肝纖維化不可逆轉(zhuǎn)。近年來，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，對于肝纖維化逆轉(zhuǎn)方面的研究已取得突破性進(jìn)展。著名肝病學(xué)家Roking

2、明確提出，人典型發(fā)生的肝硬化完全可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)。因此，關(guān)于肝纖維化發(fā)生機(jī)制以及肝纖維化治療等方面的研究成為近十多年來世界醫(yī)學(xué)攻關(guān)中的熱點(diǎn)。 目前，臨床上有效的抗肝纖維化藥物不多，秋水仙喊、糖皮質(zhì)激素、青霉胺等抗肝纖維化的藥物臨床療效不十分肯定，且嚴(yán)重的副作用較多，從而限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。中草藥抗肝纖維化的研究一直比較活躍。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些中草藥具有抗肝纖維化的作用。 大量的研究已經(jīng)證實(shí)，具有抗氧化作用的營養(yǎng)素如

3、維生素A、E、C、硒、?；撬岬染哂蓄A(yù)防肝纖維化的作用。因?yàn)闋I養(yǎng)因素預(yù)防和治療肝纖維化具有安全、副作用小、可長期堅持等優(yōu)點(diǎn)，因此，開發(fā)研究具有抗肝纖維化作用的營養(yǎng)素及營養(yǎng)活性成分具有十分重要的應(yīng)用價值。 β-葡聚糖是從大麥以及燕麥中提取的一種低聚糖，屬于可溶性食物纖維，已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)β-葡聚糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、保護(hù)肝臟功能、促進(jìn)腸道益生菌生長等作用，關(guān)于其是否具有抗肝纖維化作用未見報道。 本課題基于現(xiàn)今關(guān)于肝纖

4、維化的最新研究進(jìn)展，用CCl4茶油溶液腹腔注射8w制備SD大鼠肝纖維化模型，然后進(jìn)行為期8w的β-葡聚糖干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，觀察β-葡聚糖對改善肝纖維化大鼠肝功能、腎功能、營養(yǎng)狀況、病理改變等以及β-葡聚糖對肝纖維化大鼠抗氧化作用、抑制炎癥反應(yīng)作用進(jìn)行研究，并采用目前最先進(jìn)的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究β-葡聚糖對纖維化大鼠肝臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)調(diào)控作用，以及其對肝纖維化信號傳導(dǎo)過程中smad3mRNA、smad7mRNA的表達(dá)調(diào)

5、控，研究β-葡聚糖對實(shí)驗(yàn)動物肝纖維化的治療作用及作用機(jī)制，為人類開發(fā)具有預(yù)防和治療肝纖維化的功能性保健食品提供科學(xué)的依據(jù)。 二、研究目的 1.觀察β-葡聚糖對纖維化大鼠肝功能的改善作用。 2.研究β-葡聚糖對肝纖維化大鼠的纖維化逆轉(zhuǎn)作用。 3.研究β-葡聚糖抗肝纖維化作用機(jī)制。 4.為人類開發(fā)具有預(yù)防和治療肝纖維化的功能性保健食品提供理論依據(jù)。 三、研究方法 1.動物實(shí)驗(yàn)

6、(1)造模方法80只SD雄性大鼠隨機(jī)分為2組：對照組及模型組。模型組70只腹腔注射40％CCl4油溶液，造模劑量2ml/kg，每w2次首次劑量未加倍。對照組10只采用相等量的生理鹽水腹腔注射每周2次。分別于造模后第4w、第6w及第8w時抽取3只肝纖維化組大鼠及2只正常對照組大鼠進(jìn)行超聲檢查，監(jiān)測肝纖維化形成的情況。 (2)干預(yù)分組及方法造模8w后經(jīng)病理切片證實(shí)肝纖維化形成。取存活的28只肝纖維化模型組動物隨機(jī)分為未經(jīng)治療的陽性對

7、照組10只、秋水仙堿治療組8只和β-葡聚糖治療組10只。另9只未造模的正常大鼠為空白對照組。實(shí)驗(yàn)期間，β-葡聚糖組每天用濃度為5％β-葡聚糖溶液灌胃，劑量10ml/kg；秋水仙堿組采用0.2g/kg的秋水仙堿溶液灌胃，陽性對照組和空白對照組用10ml/kg的生理鹽水灌胃。 1.生化檢測：觀察β-葡聚糖對纖維化大鼠肝、腎功能、蛋白合成的改善作用。采用日本日立7600-020型全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清ALT、AST、AKP、

8、γ-GT、總膽汁酸、直接膽紅素、總膽紅素、血清總蛋白、白蛋白、前白蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸、鉀、鈉、氯、鈣、磷、鎂、鐵等指標(biāo)。 2.病理觀察：采用HE染色及膠原染色觀察β-葡聚糖對纖維化大鼠的肝病理改變。 3.檢測抗氧化酶學(xué)指標(biāo)：采用試劑盒檢測血清SOD、MDA水平改變。 4.細(xì)胞因子檢測：免疫組化方法檢測大鼠血清TNF-α、IL-2表達(dá)情況改變。 5.表達(dá)調(diào)控檢測：采用實(shí)時熒光定量PCR

9、技術(shù)檢測β-葡聚糖對纖維化大鼠肝臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)調(diào)控作用，以及其對肝纖維化信號傳導(dǎo)過程中smad3mRNA、smad7mRNA的表達(dá)調(diào)控，以及PPAR-αmRNA、TNF-αmRNA表達(dá)的影響。 四、研究結(jié)果 1.動物實(shí)驗(yàn)干預(yù)研究 (1)β-葡聚糖可以改善肝纖維化大鼠的肝功能，β-葡聚糖治療組血清ALT、AST、AKP、γ-GT、總蛋白、白蛋白、球蛋白、以及總膽汁酸、直接膽紅素、總膽紅素以及腎功

10、能指標(biāo)BUN、Cr均較肝纖維化陽性對照組有所改善。 (2)β-葡聚糖可以預(yù)防和治療CCl4所致大鼠肝纖維化。 2.β-葡聚糖治療肝纖維化機(jī)制研究(1)β-葡聚糖治療組以及秋水仙堿治療組SOD高于肝纖維化陽性對照組，而MDA及低于肝纖維化對照組。 (2)β-葡聚糖能夠抑制血清IL-2表達(dá)： (3)β-葡聚糖治療組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平明顯低于陽性對照組。 (4)β-葡聚糖治療smad3m

11、RNA表達(dá)水平明顯低于陽性對照組Smad7mRNA表達(dá)水平明顯高于陽性對照組。 (5)β-葡聚糖治療組TNF-αmRNA表達(dá)水平明顯低于陽性對照組。 五、研究結(jié)論 1.成功地用40％CCl4茶油溶液腹腔注射復(fù)制了大鼠肝纖維化模型。 2.β-葡聚糖具有治療和預(yù)防實(shí)驗(yàn)大鼠肝纖維化作用，其機(jī)制可能是通過改善和保護(hù)肝細(xì)胞功能、抑制炎癥反應(yīng)、下調(diào)肝纖維化大鼠Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平、下調(diào)smad3mRNA