苦參堿結(jié)構(gòu)修飾物-19抗大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指在各種致病因子如炎癥、損傷、藥物、遺傳因素等的作用下，活化的成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts, MFs）增多，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）大量沉積的病理改變。它是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)，亦是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過(guò)程。肝纖維化為一動(dòng)態(tài)過(guò)程，屬可逆性病變，因此

2、，阻斷、抑制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療慢性肝病的一個(gè)重要目標(biāo)。
　　 既往認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts）的最主要來(lái)源[1-3]。但是，晚近研究表明原位間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞[4,5]，尤其是膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞也被證明可通過(guò)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-to-mesenchymaltransition, EMT）向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6,7

3、]，表明肝實(shí)質(zhì)的上皮細(xì)胞也參與肝纖維化進(jìn)程。
　　 苦參堿是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥苦參中提取的一種生物堿，目前的研究發(fā)現(xiàn)其抗炎，免疫調(diào)節(jié)，對(duì)小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用,并能抗大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用。雖然苦參堿的藥理作用廣泛，但是活性不高，需要對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到活性更強(qiáng)、毒性更低的衍生物。再者，苦參堿的藥理作用機(jī)制不明確，特別是其靶標(biāo)蛋白的研究仍是空白。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿的羰基氧原子被硫原子取代后，其藥理活性

4、大為增強(qiáng)，為此我們對(duì)苦參堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到40多個(gè)苦參堿衍生物。本研究首先對(duì)部分苦參堿衍生物進(jìn)行抗RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α作用和抑制NF-кB 轉(zhuǎn)錄活性的篩選，挑選出藥效高，毒性低的苦參堿衍生物-19（M-19）；接著對(duì)M-19 治療BDL和DMN 誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，并初步探討M-19 阻遏EMT 進(jìn)程是其抗肝纖維化的作用機(jī)制之一；對(duì)M-19 抑制TGF-β1誘導(dǎo)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、原代培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞和肝星狀

5、細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞EMT 進(jìn)程的阻斷，以及對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用的研究，闡釋M-19抗肝纖維化的多環(huán)節(jié)機(jī)制；通過(guò)連續(xù)親和色譜法、競(jìng)爭(zhēng)親和色譜法結(jié)合MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜鑒定等技術(shù)，確證Mat及M-19的特異結(jié)合蛋白為核糖體蛋白S5(RPS5)。通過(guò)免疫組化和Real-time PCR 檢測(cè)RPS5在纖維化模型大鼠組織中表達(dá)變化，以及RPS5在原代肝星狀細(xì)胞和HSC-T6細(xì)胞EMT中的作用研究，推測(cè)Mat及

6、M-19 可能通過(guò)抑制肝臟細(xì)胞RPS5的降解或表達(dá)水平的下降，而發(fā)揮抗肝纖維化作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、苦參堿衍生物抗RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α和抑制NF-кB 轉(zhuǎn)錄活性篩選
　　 （一）采用MTT 法測(cè)定不同濃度的苦參堿及苦參堿衍生物處理24h，對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，以比較藥物的細(xì)胞毒性作用，并確定安全的藥理作用濃度范圍。
　　 （二）分別采用細(xì)胞毒結(jié)晶紫法和ELISA

7、 法對(duì)LPS 刺激的RAW264.7細(xì)胞上清中的TNF-α生物學(xué)活性和含量進(jìn)行測(cè)定，比較苦參堿和一系列苦參堿衍生物對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的抑制作用，篩選出高活性衍生物。
　　 （三）采用雙熒光素酶報(bào)告基因法，測(cè)定苦參堿衍生物對(duì)LPS 刺激的RAW264.7細(xì)胞NF-кB 轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，進(jìn)一步比較藥物的藥理活性。
　　 二、苦參堿及苦參堿衍生物-19抗大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用研究
　　 （一）苦參

8、堿及苦參堿衍生物-19對(duì)BDL大鼠肝纖維化的抑制作用將雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組，假手術(shù)組6只，其余各組10只，分設(shè)假手術(shù)組、膽總管結(jié)扎組、苦參堿衍生物-19：12.5mg/kg、 25mg/kg和50mg/kg 治療組，苦參堿50mg/kg 治療組,氧化苦參堿50mg/kg 治療組。鈍性分離并結(jié)扎膽總管，制備BDL 肝纖維化模型。術(shù)后3d，各藥物組灌胃給予相應(yīng)藥物處理，假手術(shù)組和膽總管接扎組灌胃生理鹽水。于接扎后第25d 處死大鼠，堿水

9、解法測(cè)定各組肝組織羥脯氨酸含量；HE 染色觀察纖維化程度，Masson和Sirius red 染色以計(jì)算ECM 含量。Realtime RT-PCR及免疫組織化學(xué)法測(cè)定肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α－平滑肌激動(dòng)蛋白（α-SMA）、鈣粘附蛋白（E-cadherin）、HNF4α和TGF-β1等EMT 相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 （二）苦參堿及苦參堿衍生物-19對(duì)DMN 損傷大鼠肝纖維化的抑制作用將雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組，對(duì)照組7只，其

10、余各組每組10只，分設(shè)假手術(shù)組、膽總管結(jié)扎組、苦參堿衍生物-19：12.5mg/kg、 25mg/kg和50mg/kg 治療組，苦參堿50mg/kg 治療組,氧化苦參堿50mg/kg 治療組。除空白對(duì)照組外，其余各組予1％DMN溶液按照10μg/kg的劑量腹腔注射，每周連續(xù)注射3次，共注射5w，制備DMN 誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型。于DMN 注射第5w 起各組灌胃給予相應(yīng)藥物治療，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水處理。藥物治療3w后處死

11、，觀察指標(biāo)同BDL模型。
　　 三、M-19 體外抗肝纖維化作用機(jī)制研究
　　 （一）M-19對(duì)原代肝細(xì)胞EMT 抑制作用研究分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后，換成含有2ng/ml TGF-β1無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和M-19：5，10,20umol/L 處理組。刺激48h后，提取細(xì)胞總RNA。ReAltime RT-PCR 法檢測(cè)肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadheri

12、n）等基因mRNA水平。
　　 （二）M-19對(duì)原代肝星狀細(xì)胞EMT 抑制作用研究分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后，換成含有2ng/ml TGF-β1無(wú)血清培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組和M-19：5，10,20umol/L 處理組。刺激24h后，提取細(xì)胞總RNA。ReAltime RT-PCR 法檢測(cè)α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。
　　 （三）M-19對(duì)肝星狀細(xì)胞系HSC

13、-T6 EMT 抑制作用研究HSC-T6細(xì)胞1.5×105/well分于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入2ng/ml TGF-β1刺激24h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、苦參堿衍生物-19：2.5，5，,10umol/L 處理組。收集細(xì)胞，提取總RNA，ReAltime RT-PCR 檢測(cè)E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平（四）M-19對(duì)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6 增殖抑制作用研究HS

14、C-T6細(xì)胞1.5×104/well分于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為0.8，4， 10, 20, 40, 100umol/L M-19，繼續(xù)處理24h 或48h。MTT 法測(cè)定細(xì)胞的增殖活性（五）M-19 誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞系HSC-T6 凋亡作用研究HSC-T6細(xì)胞1.5×104/well分于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入終濃度為10，20，40umol/L的M-19，繼續(xù)處理24h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率四、

15、MAT和M-19 特異結(jié)合蛋白的研究。
　　 結(jié)論：
　　 一、M-19和M-24對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性抑制作用較小，對(duì)LPS 刺激RAW細(xì)胞釋放TNF-α抑制作用好于苦參堿及同類苦參堿衍生物，并具有抑制NF-кB 轉(zhuǎn)錄活性作用。
　　 二、M-19 可抑制BDL 或DMN 肝纖維化大鼠肝組織EMT 進(jìn)程，降低肝臟ECM沉積，具有抗肝纖維化作用。
　　 三、M-19抗肝纖維化作用機(jī)制與其抑制肝細(xì)