741楊葉不定根發(fā)生調(diào)控及IAA免疫化學(xué)分析.pdf

1、不定根發(fā)生既是植物器官分化的重要理論問題，又是無性繁殖和完整植株再生等林業(yè)重要實踐的關(guān)鍵。成功地誘導(dǎo)不定根，對實現(xiàn)無性繁殖獲得最大遺傳增益以及轉(zhuǎn)基因材料的完整植株再生都具有重要的實踐意義。本研究以741楊試管苗為試材，系統(tǒng)地研究了影響不定根發(fā)生的因素，探討最優(yōu)化的不定根發(fā)生的研究體系，并且著重從激素調(diào)控、解剖學(xué)、IAA免疫組織化學(xué)定位等方面對不定根發(fā)生調(diào)控機制進行了研究。主要結(jié)果如下：
　　1.建立了高效、同步和穩(wěn)定性好的741楊

2、葉不定根發(fā)生體系。對741楊不同發(fā)育狀態(tài)、不同外植體以及生長調(diào)節(jié)劑IBA水平進行了系統(tǒng)的研究，確定了以741楊生根試管苗上的葉為材料，在1/2MS附加0.5mg/L IBA培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)。利用這一體系，生根時間集中誘導(dǎo)后6-8天，第8天生根率達到100％，平均生根條數(shù)為3.7條/葉，重復(fù)試驗的結(jié)果表明該體系具有較好的穩(wěn)定性。
　　2.施用生長素極性運輸抑制劑TIBA，明顯地地抑制了741楊葉不定根發(fā)生，表明IAA極性運輸在不

3、定根發(fā)生中發(fā)揮重要作用。采取培養(yǎng)基中添加和葉片涂抹方法進行TIBA處理，TIBA為5mg/L時，第8天生根率為52.2％，比對照降低了47.8％；TIBA濃度為10mg/L時，第8天生根率為5.6％，比對照降低了94.4％；TIBA濃度為20mg/L時，第8天生根率為0，且葉柄基部長出了愈傷；TIBA濃度為100mg/L時，葉受到毒害，葉片變黃。因此，TIBA抑制不定根發(fā)生的較適宜濃度為10mg/L.
　　3.解剖學(xué)試驗結(jié)果表明：

4、741楊葉不定根屬于誘生根原基類型，根原基起源于形成層，其發(fā)生過程為：形成層細胞縱向和橫向分裂加快形成分生組織細胞群，分生組織進一步分裂分化形成根原基，根原基生長發(fā)育形成根，根穿過皮層突破表皮，形成不定根。
　　4.以741楊嫩莖和核桃幼胚為材料，優(yōu)化和改進了木本植物IAA免疫膠體金定位體系。1）針對木本植物組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜、抗原往往深藏在蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)中的特點，用尿素-胰蛋白酶聯(lián)合消化技術(shù)對抗原進行了修復(fù)。使修復(fù)后的抗原充分暴露出來，

5、抗體很容易接近；2）提高了緩沖液中Triton X-100的用量。從而增強了細胞膜的通透性，使抗體更容易滲透到細胞內(nèi)部并與IAA反應(yīng)；3）在緩沖液中加入了2.5％牛血清白蛋白，消除了背景染色。牛血清白蛋白不僅能降低非特異性吸附，抑制非特異性染色，還可封閉抗血清中混雜的白蛋白抗體；4）抗原抗體反應(yīng)由4℃反應(yīng)過夜改為37℃反應(yīng)2h，縮短了反應(yīng)時間，提高了效率。通過染色技術(shù)的改進，獲得了很好的結(jié)果：敏感性高，特異性強，背景清晰，耗時少。

6、>　　5.741楊葉不定根發(fā)生過程中IAA免疫膠體金定位結(jié)果顯示，不定根誘導(dǎo)階段葉柄形成層有明顯的IAA積累，即IAA在葉柄形成層中的積累與不定根的分化密切相關(guān)，施用10mg/L TIBA，明顯地延緩了IAA在葉柄形成層中積累，延緩了生根時間，降低了生根率。具體的結(jié)果是：誘導(dǎo)前（0d），葉柄中IAA分布較少，表皮和皮層的金顆粒密度為4.8個/100um2，維管組織的金顆粒密度為5.1個/100um2；不定根誘導(dǎo)初期（1~3d），IAA主

7、要分布在加厚的形成層及其周緣維管束，其金顆粒密度為216.8個/100um2；不定根原基形成階段（3～5d），IAA大量積累在根原基細胞群，其金顆粒密度為345.7個/100um2；不定根伸長階段（6～7d），IAA集中分布根尖生長點和根中柱鞘，其金顆粒密度分別為210.5和32.3個/100um2；施用生長素極性運輸抑制劑TIBA，顯著地推遲了生根時間，降低了生根率，TIBA施用后第3天，葉柄中的IAA含量仍然很少，表皮和皮層的金顆粒

8、密度為6.9個/100um2，維管組織的密度為8.7個/100um2；第6天，IAA集中分布在維管組織，其金顆粒密度為150.2個/100um2;第8天，IAA集中分布在根原基，其金顆粒密度為300.5個/100um2；第10天，IAA集中分布在根尖和根維管，其金顆粒密度分別為220.4個/100 um2和30.1個/100um2。
　　6.利用免疫膠體金電鏡技術(shù)對葉不定根發(fā)生過程中的IAA亞細胞分布進行了分析。在不定根誘導(dǎo)初期和