用于活體斑馬魚全腦成像的光片照明顯微鏡研究.pdf

1、腦作為動物體最重要的器官之一，其龐雜的結(jié)構(gòu)以及豐富的功能長久以來一直是人們研究腦的主要對象和關(guān)鍵問題。光學(xué)顯微成像方法作為近年來突飛猛進(jìn)的手段，已經(jīng)被逐漸廣泛地應(yīng)用于腦科學(xué)研究中。在眾多的光學(xué)顯微成像方法中，光片照明顯微成像術(shù)近年發(fā)展迅速，由于其具有的三維細(xì)胞水平分辨率，快速面成像以及低光漂白等特性，在腦成像領(lǐng)域嶄露頭角，尤其是在透活體斑馬魚腦成像方面受到了廣泛的關(guān)注。
　　然而，斑馬魚全腦成像要求光學(xué)顯微鏡能夠在覆蓋全腦的三維成

2、像過程中獲取每個單細(xì)胞在秒量級時間尺度下的神經(jīng)活動，這對傳統(tǒng)光片照明顯微鏡提出了重大的挑戰(zhàn)，而對于該問題的攻克也是國際相關(guān)課題組研究的重點問題。本文基于光片照明的活體斑馬魚全腦顯微成像系統(tǒng)展開研究，提出了雙縫共聚焦光片照明成像方法，建立了斑馬魚全腦神經(jīng)活動與行為的同步記錄的成像方法。
　　本研究首先發(fā)展了基于柱透鏡的靜態(tài)光片照明成像系統(tǒng)，通過對系統(tǒng)成像性能的理論分析與實驗，對光片照明顯微成像方法的物理成像過程進(jìn)行了分析。通過軟硬件

3、設(shè)計以及光路搭建，得到橫向分辨率1.1μm、縱向分辨率5.9μm，視場800μm，成像速度15幀每秒的成像系統(tǒng)。采用系統(tǒng)實現(xiàn)了斑馬魚全腦結(jié)構(gòu)成像與三維重建研究。結(jié)合斑馬魚成像的需求對該方法的信噪比以及三維成像速度方面的不足進(jìn)行了討論。
　　基于對以上光片照明顯微成像方法成像信噪比的理論分析，結(jié)合新型成像器件的成像原理，提出通過雙光束掃描與雙縫探測的光片照明顯微成像方法用于斑馬魚全腦功能成像。通過理論計算以及實驗研究，證明該方法能夠

4、在快速成像的前提下，實現(xiàn)了成像信噪比的有效提升。同時，系統(tǒng)研究了狹縫共聚焦成像過程中信噪比隨狹縫寬度變化的物理過程。經(jīng)過系統(tǒng)搭建以及活體斑馬魚腦成像的研究，證明了該方法具有分辨精細(xì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及快速神經(jīng)活動的優(yōu)勢，為全腦神經(jīng)功能成像研究提供了有效手段。
　　在已有研究的基礎(chǔ)上，發(fā)展了用于自然狀態(tài)下斑馬魚全腦三維神經(jīng)功能成像的光片照明成像方法，通過動態(tài)光片的三維掃描實現(xiàn)了快速三維數(shù)據(jù)的獲取。系統(tǒng)的活體斑馬魚成像實驗證明了系統(tǒng)具有1秒每

5、個三維數(shù)據(jù)集（1500μm×1500μm×200μm）的單細(xì)胞分辨高速熒光成像能力。進(jìn)一步地，為了實現(xiàn)斑馬魚從單細(xì)胞水平的神經(jīng)活動到行為的全面成像研究，發(fā)展了基于微鏡陣列的同步光刺激與行為記錄方法，實現(xiàn)了與三維快速腦成像同步的空間光刺激以及全局的行為記錄。通過搭建系統(tǒng)，實現(xiàn)了斑馬魚在外界刺激下行為及全腦神經(jīng)功能同步成像，證明了系統(tǒng)在單細(xì)胞活動到生物整體行為的全面研究方面的能力。
　　通過本文的研究，有希望為光學(xué)手段在生物體的全腦神