原位乳腺癌上皮間質轉化相關細胞學特性的活體雙光子顯微鏡成像研究.pdf

1、目的:
　　在2012年CDC(Centers for Disease Control)腫瘤統(tǒng)計數據中，乳腺癌的發(fā)病率，已成為僅次于肺癌的第二位，并且在死亡率中排第五位。而在女性人群中，乳腺癌是患病率以及死亡率均最高的惡性腫瘤。而遠處轉移發(fā)生，包括肺、骨骼及腦內轉移，成為乳腺癌患者致死的主要原因。上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞在一些因素的作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力，變成具備間質細胞形

2、態(tài)和特性的細胞的過程，不僅在胚胎發(fā)育中起到了重要作用，現在的理論認為，EMT過程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，尤其是遠處轉移的過程中，起到了重要的作用。因此，深入的研究了解EMT過程，可更進一步的了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的模式，為乳腺癌治療及減少遠處轉移的發(fā)生提供一種可行思路。而目前的關于EMT過程在腫瘤內的作用都是來源于腫瘤細胞系的培養(yǎng)或是離體腫瘤切片的分子生物學檢測，缺乏直接的活體研究數據，對于認識EMT過程的活體特征仍然十分欠缺。基于以上的研究背

3、景，本課題擬采用EMT驅動的熒光蛋白轉變轉基因小鼠乳腺癌模型，結合雙光子顯微鏡活體成像，同時探索離體腫瘤及活體原位乳腺癌內EMT過程相關的腫瘤細胞形態(tài)學及功能學變化，同時，利用此模型及成像方法，探索抗腫瘤藥物對EMT過程影響的活體特點，為EMT過程在原位乳腺癌內的存在以及活體細胞學特征提供直接的影像學證據，并為抗腫瘤藥物對EMT過程的影響提供直接的影像學監(jiān)測方法，為進一步乳腺癌治療的研究提供新的思路。
　　方法:
　　EMT

4、介導的熒光轉變指示乳腺癌小鼠模型的構建及鑒定
　　本課題采用EMT驅動的熒光蛋白轉變轉基因小鼠乳腺癌模型，小鼠體內攜帶MMTV-PyMT、Fsp1-Cre以及Rosa26Loxp-RFP-GFP報告基因，獲取轉基因小鼠自發(fā)原位乳腺癌，消化獲得原代乳腺癌細胞，經流式細胞儀篩選，獲得純RFP陽性腫瘤細胞。經細胞培養(yǎng)基免疫細胞染色，驗證RFP-GFP熒光蛋白轉變與細胞上皮-間質表型變化之間的關系，驗證轉基因小鼠乳腺癌模型的可行性。將篩選

5、的RFP陽性腫瘤細胞種植于SCID小鼠乳腺脂肪墊內，形成原位乳腺癌，利用在體皮瓣成形術暴露原位腫瘤，進行雙光子顯微鏡成像，來驗證雙光子纖維性活體乳腺癌模型成像的可行性。
　　離體細胞EMT過程的影像學特征及小鼠原位乳腺癌內EMT過程活體細胞學特性研究
　　利用篩選的純RFP陽性細胞，經完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并利用細胞連續(xù)成像設備進行動態(tài)成像，觀測離體細胞EMT過程發(fā)生過程中細胞信號及形態(tài)學變化，來呈現離體腫瘤細胞EMT發(fā)生的過程。

6、利用雙光子顯微鏡小鼠原位乳腺癌活體成像，經同視野連續(xù)動態(tài)成像，獲取在體原位腫瘤內EMT過程發(fā)生過程中細胞信號及形態(tài)學變化，獲取活體腫瘤內EMT過程發(fā)生過程的影像學資料。分析活體成像所獲得的EMT后GFP陽性細胞的與細胞侵襲轉移相關的細胞形態(tài)學特征及運動學數據，并利用腫瘤切片的全切片成像，分析EMT發(fā)生在腫瘤內的分布特征，綜合分析EMT后腫瘤細胞對腫瘤生長及侵襲遷移所起的作用。
　　抗腫瘤藥物對原位乳腺癌內EMT過程影響的活體影像學

7、研究
　　經乳腺癌患者腫瘤基因數據庫的篩選，選定c-Met靶向藥物卡博替尼(Cabozantinib，XL-184)作為抗腫瘤藥物，首先在離體篩選的腫瘤細胞內驗證藥物對體外TGF-β所誘導的EMT過程的影響。經藥物處理的小鼠，首先觀察藥物對原位乳腺癌生長速度的影響，藥物處理后，經雙光子顯微鏡原位腫瘤活體成像，觀察腫瘤內GFP陽性細胞的分布特點、細胞學形態(tài)特點，與對照組比較，分析藥物處理對原位腫瘤內EMT過程的影響，并利用腫瘤切片免

8、疫染色驗證其細胞表型變化。
　　結果:
　　1.經過原代分離的腫瘤細胞，經過篩選、培養(yǎng)，并利用上皮表型表面標志物E-cadherin進行免疫染色，結果證實當腫瘤細胞由RFP陽性轉變?yōu)镚FP陽性時，腫瘤細胞發(fā)生了EMT過程，失去了上皮細胞表型標志物，向間質細胞表型轉變，證實了此轉基因小鼠腫瘤模型可用熒光蛋白顏色的轉變來標識EMT過程的發(fā)生。在種植的小鼠原位乳腺癌活體雙光子顯微鏡成像中，原位腫瘤內可見GFP陽性細胞的散在分布，證

9、實雙光子顯微鏡可用于原位腫瘤內EMT過程的活體成像。
　　2.經培養(yǎng)細胞連續(xù)動態(tài)成像，獲得了腫瘤細胞由原先無GFP表達至GFP強陽性表達的過程，并且在此過程中，腫瘤細胞形態(tài)逐漸向長梭形發(fā)生改變，并且類似的過程在原位乳腺癌活體成像中也被獲取到，即離體及在體腫瘤內EMT過程的影像學變化被成功獲取。
　　3.EMT后腫瘤細胞形態(tài)學分析結果表示，腫瘤細胞發(fā)生EMT后，絕大部分細胞(96.55％)變?yōu)榫哂羞w移侵襲表征的細胞學形態(tài)，而僅

10、有少部分(3.45％)細胞變?yōu)槟[瘤相關成纖維細胞參與腫瘤生長發(fā)展的調節(jié)。并且經EMT，腫瘤細胞獲得了更多的侵襲相關形態(tài)學特征，呈長梭形、具有更多細胞膜突起，在腫瘤小葉內移動較緩慢，而在血管間隙邊緣時移動加速，且血管間隙邊緣細胞移動呈簇狀，形成”cell streaming”。
　　4.在離體腫瘤細胞培養(yǎng)下，藥物XL-184逆轉了TGF-β所誘導的EMT過程，而在活體原位乳腺癌中，XL-184抑制了腫瘤的生長，活體雙光子顯微鏡成像可

11、見腫瘤內呈簇狀分布的GFP陽性細胞，細胞形態(tài)類似于周邊RFP陽性上皮表型細胞，經免疫染色證實簇狀GFP陽性細胞表達E-cadherin，為上皮表型細胞。
　　結論:
　　EMT驅動的熒光蛋白轉變轉基因小鼠乳腺癌模型結合雙光子顯微鏡活體成像，成功地進行了原位乳腺癌內EMT過程的活體成像，并且獲得了離體細胞及活體原位乳腺癌內細胞水平EMT過程的直接影像學證據。經過細胞形態(tài)學分析，可見EMT過程后，腫瘤細胞主要表現為具有遷移侵襲表