原位乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞學(xué)特性的活體雙光子顯微鏡成像研究.pdf

1、目的:
　　在2012年CDC(Centers for Disease Control)腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，乳腺癌的發(fā)病率，已成為僅次于肺癌的第二位，并且在死亡率中排第五位。而在女性人群中，乳腺癌是患病率以及死亡率均最高的惡性腫瘤。而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生，包括肺、骨骼及腦內(nèi)轉(zhuǎn)移，成為乳腺癌患者致死的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在一些因素的作用下，失去極性及細(xì)胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力，變成具備間質(zhì)細(xì)胞形

2、態(tài)和特性的細(xì)胞的過程，不僅在胚胎發(fā)育中起到了重要作用，現(xiàn)在的理論認(rèn)為，EMT過程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，尤其是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中，起到了重要的作用。因此，深入的研究了解EMT過程，可更進一步的了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的模式，為乳腺癌治療及減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供一種可行思路。而目前的關(guān)于EMT過程在腫瘤內(nèi)的作用都是來源于腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)或是離體腫瘤切片的分子生物學(xué)檢測，缺乏直接的活體研究數(shù)據(jù)，對于認(rèn)識EMT過程的活體特征仍然十分欠缺?；谝陨系难芯勘?/p>

3、景，本課題擬采用EMT驅(qū)動的熒光蛋白轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型，結(jié)合雙光子顯微鏡活體成像，同時探索離體腫瘤及活體原位乳腺癌內(nèi)EMT過程相關(guān)的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)及功能學(xué)變化，同時，利用此模型及成像方法，探索抗腫瘤藥物對EMT過程影響的活體特點，為EMT過程在原位乳腺癌內(nèi)的存在以及活體細(xì)胞學(xué)特征提供直接的影像學(xué)證據(jù)，并為抗腫瘤藥物對EMT過程的影響提供直接的影像學(xué)監(jiān)測方法，為進一步乳腺癌治療的研究提供新的思路。
　　方法:
　　EMT

4、介導(dǎo)的熒光轉(zhuǎn)變指示乳腺癌小鼠模型的構(gòu)建及鑒定
　　本課題采用EMT驅(qū)動的熒光蛋白轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型，小鼠體內(nèi)攜帶MMTV-PyMT、Fsp1-Cre以及Rosa26Loxp-RFP-GFP報告基因，獲取轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)原位乳腺癌，消化獲得原代乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選，獲得純RFP陽性腫瘤細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基免疫細(xì)胞染色，驗證RFP-GFP熒光蛋白轉(zhuǎn)變與細(xì)胞上皮-間質(zhì)表型變化之間的關(guān)系，驗證轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型的可行性。將篩選

5、的RFP陽性腫瘤細(xì)胞種植于SCID小鼠乳腺脂肪墊內(nèi)，形成原位乳腺癌，利用在體皮瓣成形術(shù)暴露原位腫瘤，進行雙光子顯微鏡成像，來驗證雙光子纖維性活體乳腺癌模型成像的可行性。
　　離體細(xì)胞EMT過程的影像學(xué)特征及小鼠原位乳腺癌內(nèi)EMT過程活體細(xì)胞學(xué)特性研究
　　利用篩選的純RFP陽性細(xì)胞，經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并利用細(xì)胞連續(xù)成像設(shè)備進行動態(tài)成像，觀測離體細(xì)胞EMT過程發(fā)生過程中細(xì)胞信號及形態(tài)學(xué)變化，來呈現(xiàn)離體腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生的過程。

6、利用雙光子顯微鏡小鼠原位乳腺癌活體成像，經(jīng)同視野連續(xù)動態(tài)成像，獲取在體原位腫瘤內(nèi)EMT過程發(fā)生過程中細(xì)胞信號及形態(tài)學(xué)變化，獲取活體腫瘤內(nèi)EMT過程發(fā)生過程的影像學(xué)資料。分析活體成像所獲得的EMT后GFP陽性細(xì)胞的與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及運動學(xué)數(shù)據(jù)，并利用腫瘤切片的全切片成像，分析EMT發(fā)生在腫瘤內(nèi)的分布特征，綜合分析EMT后腫瘤細(xì)胞對腫瘤生長及侵襲遷移所起的作用。
　　抗腫瘤藥物對原位乳腺癌內(nèi)EMT過程影響的活體影像學(xué)

7、研究
　　經(jīng)乳腺癌患者腫瘤基因數(shù)據(jù)庫的篩選，選定c-Met靶向藥物卡博替尼(Cabozantinib，XL-184)作為抗腫瘤藥物，首先在離體篩選的腫瘤細(xì)胞內(nèi)驗證藥物對體外TGF-β所誘導(dǎo)的EMT過程的影響。經(jīng)藥物處理的小鼠，首先觀察藥物對原位乳腺癌生長速度的影響，藥物處理后，經(jīng)雙光子顯微鏡原位腫瘤活體成像，觀察腫瘤內(nèi)GFP陽性細(xì)胞的分布特點、細(xì)胞學(xué)形態(tài)特點，與對照組比較，分析藥物處理對原位腫瘤內(nèi)EMT過程的影響，并利用腫瘤切片免

8、疫染色驗證其細(xì)胞表型變化。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過原代分離的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過篩選、培養(yǎng)，并利用上皮表型表面標(biāo)志物E-cadherin進行免疫染色，結(jié)果證實當(dāng)腫瘤細(xì)胞由RFP陽性轉(zhuǎn)變?yōu)镚FP陽性時，腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT過程，失去了上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物，向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，證實了此轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型可用熒光蛋白顏色的轉(zhuǎn)變來標(biāo)識EMT過程的發(fā)生。在種植的小鼠原位乳腺癌活體雙光子顯微鏡成像中，原位腫瘤內(nèi)可見GFP陽性細(xì)胞的散在分布，證

9、實雙光子顯微鏡可用于原位腫瘤內(nèi)EMT過程的活體成像。
　　2.經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)動態(tài)成像，獲得了腫瘤細(xì)胞由原先無GFP表達(dá)至GFP強陽性表達(dá)的過程，并且在此過程中，腫瘤細(xì)胞形態(tài)逐漸向長梭形發(fā)生改變，并且類似的過程在原位乳腺癌活體成像中也被獲取到，即離體及在體腫瘤內(nèi)EMT過程的影像學(xué)變化被成功獲取。
　　3.EMT后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表示，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，絕大部分細(xì)胞(96.55％)變?yōu)榫哂羞w移侵襲表征的細(xì)胞學(xué)形態(tài)，而僅

10、有少部分(3.45％)細(xì)胞變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞參與腫瘤生長發(fā)展的調(diào)節(jié)。并且經(jīng)EMT，腫瘤細(xì)胞獲得了更多的侵襲相關(guān)形態(tài)學(xué)特征，呈長梭形、具有更多細(xì)胞膜突起，在腫瘤小葉內(nèi)移動較緩慢，而在血管間隙邊緣時移動加速，且血管間隙邊緣細(xì)胞移動呈簇狀，形成”cell streaming”。
　　4.在離體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)下，藥物XL-184逆轉(zhuǎn)了TGF-β所誘導(dǎo)的EMT過程，而在活體原位乳腺癌中，XL-184抑制了腫瘤的生長，活體雙光子顯微鏡成像可

11、見腫瘤內(nèi)呈簇狀分布的GFP陽性細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)類似于周邊RFP陽性上皮表型細(xì)胞，經(jīng)免疫染色證實簇狀GFP陽性細(xì)胞表達(dá)E-cadherin，為上皮表型細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　EMT驅(qū)動的熒光蛋白轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型結(jié)合雙光子顯微鏡活體成像，成功地進行了原位乳腺癌內(nèi)EMT過程的活體成像，并且獲得了離體細(xì)胞及活體原位乳腺癌內(nèi)細(xì)胞水平EMT過程的直接影像學(xué)證據(jù)。經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，可見EMT過程后，腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)為具有遷移侵襲表