調(diào)控干細胞能量代謝在體構(gòu)建小口徑組織工程血管.pdf

1、在過去三十年中，心腦血管疾病始終是我國城鄉(xiāng)居民的首位死因。盡管近些年來由于藥物的使用以及介入技術(shù)的發(fā)展，部分心腦血管事件的死亡率得到了控制。但是，最終越來越多的病人仍然需要進行血管置換手術(shù)或心臟搭橋手術(shù)，這些手術(shù)都需要血管替代物。此外，血管替代物在腫瘤、外傷、炎癥引起的血管病變、動脈瘤、動脈夾層以及血液透析等方面也有著巨大的臨床需求。臨床上，血管替代物主要來源于自體血管或人工血管。使用自體血管移植存在以下問題:1.自體血管數(shù)量有限，疾病

2、狀態(tài)下的自體血管質(zhì)量不高;2.在取供體血管時會造成局部創(chuàng)傷，增加了手術(shù)時間以及病人的負擔。而現(xiàn)階段應用于臨床的人工血管主要為滌綸或不可降解的高聚合物，這類人工血管不僅需要長期的抗凝藥物支持，而且作為異物不能被機體吸收，彈性較差。它們僅可應用于大口徑血管的替換。而針對小口徑（直徑＜6mm）的血管替換，還沒有可應用于臨床的血管移植物產(chǎn)品。因此，研發(fā)新型的小口徑人工血管迫在眉睫。
　　現(xiàn)有實驗研究表明，小于6mm的人工血管長期通暢率很低

3、。影響小口徑人工血管通暢率的主要因素為1.急性血栓;2.內(nèi)膜增生導致的管腔狹窄。血管移植物移植后直接接觸血液，作為異物很容易與血液相互作用形成血栓。因此，避免急性血栓形成是維持血管移植物早期通暢的關(guān)鍵。而內(nèi)膜增生是由各種原因引起的血管移植物內(nèi)的平滑肌異常增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積而導致的血管內(nèi)膜層增厚。內(nèi)膜增生是致使血管晚期堵塞的重要原因。在正常血管的表面覆蓋有內(nèi)皮層，其對防止血栓形成和維持血管的穩(wěn)態(tài)有著重要作用。對于人工血管來說，在其血

4、管內(nèi)腔內(nèi)皮化越早，血小板聚集、血栓形成的風險就會越小。人工血管的內(nèi)皮化同樣會對后期內(nèi)膜異常增生起到抑制作用。因此促進內(nèi)皮化是人工血管維持通暢的關(guān)鍵。
　　目前的研究發(fā)現(xiàn)，人工血管的內(nèi)皮化主要涉及以下機制，吻合口附近內(nèi)皮細胞越過吻合口向組織工程血管爬行，以及循環(huán)內(nèi)皮祖細胞遷移歸巢至血管表面形成內(nèi)皮層。由于吻合口兩端的內(nèi)皮細胞爬行的距離很有限，因此血管移植物中段的內(nèi)皮化主要由內(nèi)皮祖細胞的遷移、歸巢、分化完成。在正常人體內(nèi)，內(nèi)皮祖細胞主

5、要參與血管內(nèi)衰老細胞的更換，歸巢并修復損傷部位，維持血管穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮祖細胞不僅能直接分化成為內(nèi)皮細胞，還可以分泌生長因子促進附近內(nèi)皮細胞生長以及血管再生。內(nèi)皮祖細胞的歸巢對于血管移植物的內(nèi)皮化具有重要的意義。因此，如何讓內(nèi)皮祖細胞更快的歸巢到組織工程血管表面，更快更好的發(fā)揮其功能是本研究的重點。
　　近些年來，關(guān)于干細胞能量代謝的研究與日俱增。研究發(fā)現(xiàn)，增加干細胞的有氧代謝水平可以有效的促進干細胞功能的發(fā)揮。因此我們猜測，是否增強內(nèi)

6、皮祖細胞的代謝狀態(tài)會改善其功能，并進一步促進組織工程血管的內(nèi)皮化。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是能夠感知細胞內(nèi)能量代謝狀況的蛋白激酶。當其感受到細胞處于能量需求狀態(tài)時會激活，從而激發(fā)其下游的信號通路，促進分解代謝，抑制合成代謝，增加細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carbox

7、amide1-β-D-ribofuranoside，AICAR)是一種常用的的AMPK的激動劑，并已經(jīng)是一種被批準應用于臨床的藥物。在此，我們使用AICAR來改善干細胞的代謝狀態(tài)，來評價其對內(nèi)皮祖細胞功能的影響，并構(gòu)建搭載AICAR納米微球的組織工程血管，建立大鼠頸動脈移植模型，觀察其對內(nèi)皮化以及通暢率的影響。
　　此外，糖尿病在全球有著極高的發(fā)病率，而糖尿病血管病變是糖尿病并發(fā)癥中普遍存在并且嚴重的并發(fā)癥之一。其血管移植術(shù)后，病

8、理狀態(tài)下參與血管移植物內(nèi)皮化的細胞的功能會減弱，血管移植物更容易發(fā)生病變以及堵塞。因此，應用于糖尿病病人的血管移植物需要更好的生物相容性并擁有抵抗體內(nèi)病理條件的功能。而針對參與血管移植物再生的干細胞功能，在病理情況下會發(fā)生怎樣改變的研究也較少。我們的組織工程血管在糖尿病模型中效果如何，尚不清楚。因此，通過在高糖情況下使用AICAR刺激內(nèi)皮祖細胞，改變其代謝功能，并觀察對內(nèi)皮祖細胞功能的影響，以及對內(nèi)皮祖細胞促組織再生功能的影響。再將AI

9、CAR修飾的組織工程血管應用于糖尿病模型，進一步驗證我們的假說。我們認為基于促進干細胞代謝的組織工程血管的研究可以為未來血管移植物的構(gòu)建提供新的思路。
　　我們對如下幾個方面進行研究
　　1、AICAR對組織工程血管種子細胞的功能影響
　　首先，我們通過羅丹明123，線粒體染色以及細胞內(nèi)ATP的檢測發(fā)現(xiàn)AICAR可以明顯促進內(nèi)皮祖細胞代謝狀態(tài)。通過平板流動腔實驗模擬體內(nèi)血流狀態(tài)發(fā)現(xiàn)代謝功能增強的內(nèi)皮祖細胞可以更多的歸巢

10、到血管表面。而通過Transwell和ELISA吸附試驗(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)實驗驗證，代謝功能增強的內(nèi)皮祖細胞的遷移功能以及旁分泌功能同樣被增強了。我們認為，通過AICAR刺激，內(nèi)皮祖細胞的代謝狀態(tài)被增強，并進一步促進了內(nèi)皮祖細胞功能。而增強功能的內(nèi)皮祖細胞對工程血管的內(nèi)皮化及血管穩(wěn)態(tài)具有重要作用。
　　此外，我們還對參與組織工程血管再生的其它細胞進行了研究。結(jié)果顯示

11、AICAR可以同抑制血小板五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和血栓素A2(ThromboxaneA2，TXA2)的分泌，維持血小板的適度聚集，促進吻合口附近的內(nèi)皮細胞的爬行，并通過G1期聚集抑制病理性平滑肌增殖，分泌功能，促進平滑肌能量代謝、自噬、分化以及正常的生理功能。
　　2、AICAR修飾的組織工程血管的構(gòu)建
　　為了驗證是否AICAR可以通過增強內(nèi)皮祖細胞的代謝和功能以及其它影響參與血管再生

12、的細胞功能，進而促進組織工程血管的內(nèi)皮化和通暢率，我們構(gòu)建了AICAR修飾的組織工程血管。通過對SD(Sprague-Dawley)大鼠頸動脈進行脫細胞處理后，去除其細胞成分，保留支架部分。這樣的血管支架擁有優(yōu)秀的生物相容性，以及力學強度。通過離子交換法制備包裹AICAR的納米微球顆粒，使AICAR具有緩釋功能。再將納米顆粒與膠原混合后與上述血管支架交聯(lián)，構(gòu)成AICAR修飾的組織工程血管。通過緩釋實驗，力學測試和毒性檢測，驗證組織工程血

13、管適合應用于移植模型。接下來，通過顯微外科的技術(shù)手段，將制備好的組織工程血管移植到SD大鼠的頸動脈中段。通過在不同時間點的取材切片觀察，發(fā)現(xiàn)AICAR修飾的組織工程血管通暢率遠遠高于對照組，內(nèi)皮化和再生速度明顯加快。我們認為AICAR可以通過促干細胞的代謝和功能，加快工程血管的內(nèi)皮化，增加血管的通暢率。
　　3、AICAR在高糖狀態(tài)下改善內(nèi)皮祖細胞能量代謝及功能。
　　進一步我們在高糖情況下對內(nèi)皮祖細胞進行培養(yǎng)并做功能檢測。

14、通過羅丹明123，線粒體染色，細胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)以及更為精確的細胞耗氧量檢測，我們發(fā)現(xiàn)AICAR可以明顯改善高糖狀態(tài)下較差的內(nèi)皮祖細胞代謝狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)高糖對內(nèi)皮祖細胞代謝功能的損傷。AICAR還可以改善組細胞增加高清情況下內(nèi)皮祖細胞的葡萄糖吸收，增加能量攝取，并減少局部的糖濃度。在自噬檢測中我們也發(fā)現(xiàn)AICAR可以促進內(nèi)皮祖細胞的自噬產(chǎn)生。這對于高糖情況下，維持高糖損傷后的內(nèi)皮祖細胞穩(wěn)

15、態(tài)具有重要的意義。而通過ELISA，Transwell實驗也驗證了，受損的內(nèi)皮祖細胞的旁分泌，遷移功能在AICAR處理后得到了恢復和增強。上述結(jié)果說明，AICAR可以逆轉(zhuǎn)高糖對于內(nèi)皮祖細胞的代謝和功能損害，而恢復的內(nèi)皮祖細胞功能會對糖尿病組織工程血管的內(nèi)皮化起到促進作用。
　　4、AICAR修飾的組織工程血管在糖尿病模型中的應用
　　內(nèi)皮祖細胞在糖尿病大血管病變以及微血管病的形成、修復中都有重要的作用。為了進一步驗證增強代謝

16、對內(nèi)皮祖細胞修復功能的作用，我們在糖尿病小鼠缺血性下肢潰瘍模型中進行了在體實驗。我們發(fā)現(xiàn)AICAR預處理后的內(nèi)皮祖細胞或糖尿病內(nèi)皮祖細胞均比未處理的內(nèi)皮祖細胞在糖尿病潰瘍組織中有著更好的細胞存活率，微血管生成和組織修復率。而AICAR預處理的AMPKa2-/-小鼠的內(nèi)皮祖細胞相比于C57BL/6J小鼠內(nèi)皮祖細胞，則有著更低的細胞存活率，微血管生成和組織修復率。因此我們認為AICAR可以通過AMPK通路，改善內(nèi)皮祖細胞在糖尿病病患體內(nèi)的存

17、活率以及血管再生功能。進一步，我們構(gòu)建了糖尿病大鼠頸動脈移植模型。通過3個月的觀察，AICAR修飾的組織工程血管仍然具有較高的通暢率。而研究證明一些應用于非糖尿病模型中具有高通暢率的組織工程血管，在糖尿病模型移植術(shù)后的通暢率卻不盡如人意。此外，我們還發(fā)現(xiàn)相比與非糖尿病模型，糖尿病模型中組織工程血管的細胞化的速度明顯減慢。
　　綜上所述，本論文通過多個動物模型的構(gòu)建以及體外實驗證明，通過模式分子AICAR的刺激增強或改善的內(nèi)皮祖細胞