骨形態(tài)發(fā)生蛋白相關(guān)信號(hào)通路在慢性腎臟病血管鈣化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：慢性腎臟?。–hronic kidney disease, CKD）患者往往合并血管鈣化，而血管鈣化是其心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）發(fā)生率和死亡率增高的主要原因。血管鈣化的發(fā)生與諸多因素相關(guān)，近年來骨形態(tài)發(fā)生蛋白相關(guān)信號(hào)通路已成為血管鈣化發(fā)生機(jī)制的研究熱點(diǎn)，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用腺嘌呤灌胃聯(lián)合高磷飼料喂養(yǎng)大鼠，建立CKD血管鈣化大鼠模型，觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白相關(guān)信號(hào)通路，包括骨形態(tài)

2、發(fā)生蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（bone morphogenetic protein-2，BMP-4）、以及受體（Bone morphogenetic protein receptor-IA，BMPR-IA）、抑制劑（Matrix Gla Protein，MGP）在大鼠主動(dòng)脈上的表達(dá)及激活情況，探討其作用機(jī)制，為臨床上早期防治CKD血管鈣化，降低患者心血管疾病的發(fā)

3、病率和死亡率提供策略。
　　方法：
　?。?） CKD血管鈣化大鼠模型制備：190-270g左右SPF（無特定病原體）雄性大鼠55只，隨機(jī)分為對(duì)照組（CON,n=20）和CKD組（CKD,n=35），適應(yīng)性喂養(yǎng)10天后，CKD組給予2.5％腺嘌呤（220-250mg/kg.d）定時(shí)灌胃，第1-4周每日一次，第5-8周隔日一次，聯(lián)合1.8%高磷大鼠飼料喂養(yǎng)；對(duì)照組予以生理鹽水（10ml/kg）灌胃，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，所有大鼠均

4、自由進(jìn)食及飲水，造模時(shí)間共8周。
　?。?）指標(biāo)檢測(cè)：第2、4、6、8周末，分別從CKD組及對(duì)照組隨機(jī)選取6只和5只大鼠處死收集標(biāo)本。處死前一天，代謝籠收集尿液，檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白定量；2%戊巴比妥鈉30-60mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、胱抑素C（Cysc）、血鈣(Ca2+)、血磷(P3-)；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清BMP-2、BMP-4含量；測(cè)量腎重

5、/體重指數(shù)；腹主動(dòng)脈取血后，快速分離腎臟，置于10%福爾馬林液固定，蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察腎臟病理改變；快速剝離主動(dòng)脈，按需分為三部分，一部分用10%中性福爾馬林固定，行Von Kossa染色、茜素紅染色；免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4、BMPR-IA（ALK3）、MGP蛋白表達(dá)；另一部分，存于裝有1ml RNA保護(hù)液的EP管中，-20℃冰箱凍存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定BMP-2、BMP-4 mRNA表達(dá)；其余部分

6、于-80℃冰箱保存，用于主動(dòng)脈鈣含量測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　1、一般情況：①死亡數(shù)：對(duì)照組大鼠全部存活；CKD組大鼠第2周出現(xiàn)死亡，死亡1只，實(shí)驗(yàn)總過程共死亡9只。②大鼠體重、腎重、腎重/體重指數(shù)：與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)相比，CKD組大鼠體重明顯降低（P＜0.05）；而腎重、腎重/體重指數(shù)均明顯增加（P＜0.05，P＜0.05）。
　　2、24h尿蛋白定量：與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)相比，CKD組大鼠24h尿蛋白定量明顯增加（P＜0.

7、01），且CKD組大鼠隨時(shí)間進(jìn)展24h尿蛋白定量逐漸增加（P＜0.01）。
　　3、血清學(xué)指標(biāo)：①BUN、Scr、Cysc：與對(duì)照組相比，CKD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清BUN、Scr、Cysc水平明顯增高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）。②血清鈣、磷、鈣磷乘積：與對(duì)照組相比，CKD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血磷及鈣磷乘積水平明顯增加（P＜0.01，P＜0.01），血鈣水平自第4周出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05）。
　　4、ELISA法

8、測(cè)定血清BMP-2、BMP-4含量：①BMP-2：與對(duì)照組相比，CKD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清BMP-2水平明顯增加（P＜0.05）。此外，CKD組大鼠血清BMP-2隨時(shí)間進(jìn)展逐漸增加（P＜0.05）。②BMP-4：與對(duì)照組相比較，CKD組大鼠血清BMP-4水平自第4周開始均較同時(shí)間點(diǎn)增高（P＜0.01）。此外，CKD組大鼠血清BMP-4水平第6周、第8周時(shí)較第4周降低（P＜0.01）。
　　5、腎臟病理改變：①肉眼：對(duì)照組大鼠腎臟大小

9、適中，顏色暗紅，表面光滑，質(zhì)地柔軟，皮髓質(zhì)分界清晰；CKD組大鼠腎臟呈“大白腎”改變，顏色灰白，表面不光滑，彈性差。②腎臟 HE染色：對(duì)照組腎臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)無異常改變。CKD組自第2周起，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，可見小管內(nèi)棕黃色物質(zhì)沉積，隨時(shí)間進(jìn)展，第4，6，8周逐漸出現(xiàn)腎小球囊腔擴(kuò)張，間質(zhì)纖維化，腎小球部分萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管減少。
　　6、主動(dòng)脈形態(tài)改變：對(duì)照組主動(dòng)脈光滑，彈性好。CKD組自第4周開始主動(dòng)脈逐漸彎曲、膨大，呈動(dòng)脈瘤樣

10、改變，彈性降低，第6，8周血管僵硬度明顯增加，可見鈣化結(jié)節(jié)形成。
　　7、主動(dòng)脈鈣染色：① Von Kossa染色：對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)主動(dòng)脈形態(tài)均正常，未見黑色顆粒物沉積。CKD組主動(dòng)脈自第4周開始出現(xiàn)黑色顆粒沉積，伴中膜平滑肌纖維斷裂，鈣化結(jié)節(jié)處尤其明顯，且隨時(shí)間進(jìn)展黑色顆粒沉積逐漸加重。②茜素紅染色：對(duì)照組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)主動(dòng)脈形態(tài)均正常，未見橘紅色物質(zhì)沉積。CKD組主動(dòng)脈自第4周開始逐漸出現(xiàn)中膜平滑肌橘紅色顆粒物沉積，伴平滑肌

11、纖維斷裂，鈣化結(jié)節(jié)處沉積更明顯，且隨時(shí)間進(jìn)展橘紅色顆粒物沉積逐漸加重。
　　8、主動(dòng)脈鈣含量：與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較，CKD組大鼠主動(dòng)脈鈣含量明顯增加（P＜0.01），且CKD組內(nèi)隨時(shí)間進(jìn)展鈣含量逐漸增加（P＜0.01）。
　　9、主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4、BMPR-IA（ALK3）、MGP免疫組化結(jié)果：對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈各時(shí)間點(diǎn)BMP-2、BMPR-IA、MGP蛋白在血管中膜平滑肌層幾乎無表達(dá)，BMP-4在各時(shí)間點(diǎn)存在少量

12、表達(dá)。與對(duì)照組相比，CKD組大鼠第4周起可見主動(dòng)脈上BMP-2、BMPR-IA、MGP蛋白表達(dá)開始明顯增加，胞質(zhì)呈棕黃色，主要分布于主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞層，且隨時(shí)間進(jìn)展，其表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P＜0.01）；BMP-4蛋白自第4周表達(dá)明顯增加，第6周、第8周較第4周稍下降，但與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較仍然明顯增高（P＜0.01）。
　　10、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4mRNA表達(dá)量：①BMP-2mRNA：對(duì)照組各時(shí)間

13、點(diǎn)主動(dòng)脈BMP-2mRNA的表達(dá)無明顯變化；與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)相比較，CKD組主動(dòng)脈BMP-2mRNA表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）。且隨時(shí)間進(jìn)展，CKD組主動(dòng)脈BMP-2mRNA表達(dá)逐漸增加（P＜0.01）。②BMP-4mRNA：與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較，CKD組主動(dòng)脈BMP-4mRNA表達(dá)量自第4周后均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；第6周、8周較第4周降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.腺嘌呤灌胃聯(lián)合高磷飼料喂養(yǎng)大鼠

14、，能夠快速建立慢性腎臟病血管鈣化動(dòng)物模型。
　　2.慢性腎臟病大鼠血管鈣化早期即存在BMP-2、BMP-4及其受體BMPR-IA（ALK3）、抑制劑MGP的蛋白及基因表達(dá)明顯增高，說明骨形態(tài)發(fā)生蛋白相關(guān)信號(hào)通路的激活參與 CKD血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。
　　3.CKD血管鈣化大鼠血清 BMP-2、BMP-4水平明顯增高，且與主動(dòng)脈鈣化程度呈正相關(guān)，可能可作為 CKD血管鈣化的血清標(biāo)志物。
　　4.慢性腎臟病血管鈣化過程中，