新型納米生物螺釘及生物股骨髁的制備與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維材料的制備及其對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：研究納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維（nano-hydroxyapatite/polyamid66/glass fiber，n-HA/PA66/GF）復(fù)合材料的細(xì)胞相容性及其對(duì)MC3T3-E成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為后期應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　制備圓片狀n-HA/PA66/GF材料并按照ISO10993標(biāo)

2、準(zhǔn)制備其浸提液。取MC3T3-E1成骨細(xì)胞，分別與圓片狀材料或其浸提液共培養(yǎng)。通過直接接觸實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡觀察及CCK-8法檢測(cè)該材料對(duì)成骨細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、增殖的影響;通過BCA法檢測(cè)材料對(duì)成骨細(xì)胞總蛋白合成的影響;通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)材料對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素分泌的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)材料浸提液對(duì)成骨細(xì)胞周期的影響;通過AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)材料對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;通過Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料對(duì)成骨

3、細(xì)胞遷移的影響;通過雙標(biāo)記間接細(xì)胞免疫熒光染色在激光共聚焦儀上觀察材料及其不同濃度的浸提液對(duì)細(xì)胞骨架及肌動(dòng)蛋白纖維分布的影響。
　　結(jié)果：
　　直接接觸實(shí)驗(yàn)表明n-HA/PA66/GF材料對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。材料周圍的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，為長(zhǎng)梭形，無空泡及細(xì)胞皺縮，貼壁生長(zhǎng)良好。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增多，實(shí)驗(yàn)組與兩對(duì)照組之間的差異在共培養(yǎng)前5天無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，在培養(yǎng)7天后實(shí)驗(yàn)

4、組細(xì)胞數(shù)量較陰性和陽性對(duì)照組多(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞總蛋白含量分別為(2.21±0.48)mg/ml、(1.68±0.25) mg/ml，BCA法檢測(cè)證實(shí)材料能促進(jìn)成骨細(xì)胞總蛋白的合成，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果證實(shí)材料能使更多細(xì)胞進(jìn)入S期而對(duì)細(xì)胞凋亡率無明顯影響。兩組細(xì)胞的凋亡率分別為7.93％±2.37％、8.31％±2.84％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。Elisa檢測(cè)的兩組細(xì)胞

5、分泌的骨鈣素含量在共培養(yǎng)1、3、5、7天時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，但在共培養(yǎng)10、14天后材料能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌骨鈣素(p＜0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示穿膜細(xì)胞數(shù)兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。掃描電鏡觀察見材料表面的成骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)整呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞之間緊密相連并通過偽足緊緊黏附在材料表面，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸呈現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)。免疫熒光結(jié)果表明不同濃度的材料浸提液對(duì)細(xì)胞骨架及肌動(dòng)蛋白纖維的極性分布無明顯影響，n-

6、HA/PA66/GF材料具有良好的細(xì)胞相容性，能為細(xì)胞的粘附與增殖提供適宜的環(huán)境。
　　結(jié)論：
　　新型n-HA/PA66/GF復(fù)合材料具有良好的成骨細(xì)胞相容性，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分泌、黏附、周期和遷移等行為均有一定調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分、納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維生物活性螺釘固定犬股骨髁間骨折的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：評(píng)估納米羥基磷灰石/聚酰胺66/玻璃纖維（nano-hydroxyapatite/po

7、lyamid66/glass fiber，n-HA/PA66/GF）生物螺釘?shù)捏w內(nèi)生物相容性、內(nèi)固定性能及骨傳導(dǎo)性能，為后期臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　通過注塑成型方法制備n-HA/PA66/GF生物活性螺釘。使用掃描電鏡觀察、能譜分析、X射線衍射分析及紅外圖譜分析對(duì)材料進(jìn)行表征。取24只成年中華田園犬，隨機(jī)分為兩組:生物螺釘實(shí)驗(yàn)組和金屬螺釘對(duì)照組。所有動(dòng)物均造股骨髁間骨折，分別使用生物螺釘及金屬螺釘固定骨折

8、。于術(shù)后4、8、12、24周行大體觀察、硬組織學(xué)切片染色檢測(cè)、CT+3D影像學(xué)檢測(cè)、三點(diǎn)彎曲生物力學(xué)測(cè)試及血常規(guī)、生化檢測(cè)，術(shù)后24周處死動(dòng)物后取肝臟、腎臟、脾臟行組織學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　掃描電鏡觀察顯示涂層在螺釘表面分布均勻，涂層與基體材料之間無相分離，結(jié)合緊密，融合為一體。涂層粒子為納米級(jí)別，呈片狀或葉狀。EDS能譜分析結(jié)果顯示涂層的主要成分為Ca和P元素，表明涂層組成為n-HA。X射線衍射(XRD)分析顯示2θ=

9、31.82°，32.90°，34.25°，38.38°，46.70°，49.52°和53.15°屬于羥基磷灰石的晶格特征峰，2θ=20.38°，23.49°為聚酰胺(PA)晶格的主峰。紅外圖譜分析(FTIR)發(fā)現(xiàn)3442cm-1處寬而強(qiáng)的吸收峰為對(duì)應(yīng)羥基(-OH)振動(dòng)吸收峰，960cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)PO43-對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，605cm-1和565cm-1吸收峰對(duì)應(yīng)PO43-的彎曲振動(dòng)，1102cm-1和1037cm-1處的吸收峰

10、對(duì)應(yīng)PO43-的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩種螺釘均能有效地固定犬髁間骨折，術(shù)后觀察兩組動(dòng)物均正常活動(dòng)，切口愈合良好。術(shù)后12周CT檢測(cè)顯示兩組動(dòng)物髁間骨折均已骨性愈合。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)n-HA/PA66/GF螺釘表面被新生骨覆蓋且新生骨不斷鈣化、成熟，骨與生物螺釘結(jié)合緊密。金屬螺釘與骨之間存在較大間隙，螺釘周圍骨組織被一層纖維組織包裹。Micro-CT檢測(cè)結(jié)果顯示使用兩種螺釘固定骨折12周后均發(fā)生骨性愈合。生物螺釘周圍較金屬螺釘

11、周圍有更多的新生骨小梁形成，生物螺釘與周圍的新生骨融為一體。生物力學(xué)測(cè)試證實(shí)兩組最大推出載荷在術(shù)后4、8、12周無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，但在術(shù)后24周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，推出生物螺釘所需的最大載荷比對(duì)照組大。術(shù)后24周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物靜脈血中堿性磷酸酶水平升高[(58.8±14.49)U/L]，檢測(cè)的血常規(guī)、生化各數(shù)值均正常。肝、脾、腎HE染色未見結(jié)構(gòu)正常，表明材料無明顯的器官毒性。
　　結(jié)論：
　　n-HA/PA6

12、6/GF生物活性螺釘具有良好的體內(nèi)相容性，內(nèi)固定性能和促進(jìn)新骨形成、成熟性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第三部分、聚氨酯/納米羥基磷灰石/聚酰胺66修復(fù)犬股骨髁缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：評(píng)估復(fù)合材料聚氨酯/納米羥基磷灰石/聚酰胺66(polyurethane/nano-hydroxyapatite/Polyamid66，PU/n-HA/PA66)修復(fù)犬股骨髁缺損的能力。
　　方法：
　　制備PU/n-HA/PA6

13、6復(fù)合材料并按照犬股骨髁實(shí)際大小加工成型為生物股骨髁。掃描電鏡觀察材料表面情況并測(cè)定其孔隙率。取16只成年中華田園犬，按隨機(jī)數(shù)字表分為兩組:PU/n-HA/PA66生物股骨髁實(shí)驗(yàn)組和自體股骨髁對(duì)照組。使用電鋸將犬股骨外髁鋸斷造股骨髁缺損模型，分別使用生物股骨髁及自體股骨髁修復(fù)缺損。術(shù)后4、8、12、24周行大體觀察、組織學(xué)檢測(cè)、免疫組化染色、CT影像學(xué)檢測(cè)及血常規(guī)、生化檢測(cè)，術(shù)后24周行肝、腎、脾組織學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　

14、　經(jīng)測(cè)定，材料孔隙率為80.89％±5.01％?？讖街饕植荚?00μm～800μm之間，孔壁上有與相鄰孔貫通的100μm～300μm微孔。術(shù)后2組動(dòng)物均活動(dòng)正常，切口愈合良好。CT影像見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的PU/n-HA/PA66股骨髁與自體股骨內(nèi)髁緊密鍵合，材料無降解，假體與脛骨平臺(tái)、股骨內(nèi)髁及髕骨的關(guān)節(jié)面匹配良好，內(nèi)外側(cè)膝關(guān)節(jié)間隙無狹窄且基本對(duì)稱。組織學(xué)檢測(cè)顯示兩組股骨髁假體均與自體骨結(jié)合緊密，生物股骨髁網(wǎng)孔中的骨小梁逐漸增多成熟。免疫組化