MiRNa-491-5p通過(guò)靶向JMJD2B抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并作為潛在胃癌診斷標(biāo)記物的研究.pdf

1、研究背景
　　胃癌(Gastric cancer)是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近些年來(lái)，雖然胃癌的發(fā)病率有所下降但其死亡率一直居高不下，成為困擾人類(lèi)健康的重大難題。從全世界范圍來(lái)看，胃癌在亞洲地區(qū)的發(fā)病率最高，在中國(guó)位居癌癥發(fā)病率的第二位。由于現(xiàn)有的胃癌診斷標(biāo)志物缺乏靈敏性和可靠性以及胃癌早期臨床指征不明顯，大多數(shù)胃癌患者一旦確診已是晚期，胃癌患者的五年生存率較低。因而，尋找新的診斷和治療胃癌的靈敏性和特異性高的的靶點(diǎn)成為當(dāng)務(wù)

2、之急。
　　本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)JMJD2B(KDM4B)，即組蛋白去甲基化酶在胃癌組織中高表達(dá)，具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的能力。然而，在胃癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，JMJD2B的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，miRNAs是單鏈非編碼的RNA分子，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的一系列生物學(xué)功能，包括調(diào)控細(xì)胞周期以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝的進(jìn)程等。因而miRNA的異常表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。鑒于此我們推測(cè)JMJD2B是否能

3、受到miRNA的調(diào)控而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)可以調(diào)控JMJD2B表達(dá)的miRNA分子，并通過(guò)一系列的細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-491-5p可以調(diào)控JMJD2B的表達(dá)，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。此外，我們通過(guò)檢測(cè)組織和血清中miR-491-5p的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-491-5p可能作為胃癌早期診斷的標(biāo)志物。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　探討在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-491-5p調(diào)控JMJD2B的分子機(jī)

4、制，以及miR-491-5p作為胃癌診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1、以JMJD2B為靶基因，通過(guò)四種生物信息學(xué)軟件(miRDB、miRanda/microRNA.org、Microcosm Targets和DIANA-microT v3.0)預(yù)測(cè)能結(jié)合在JMJD2B3' UTR端的潛在miRNA，綜合分析后挑選出miR-491-5p作為研究分子。利用QRT-PCR檢測(cè)不同的胃癌細(xì)胞系(BGC823、 MGC80

5、3、SGC7901和HGC27)中miR-491-5p的表達(dá)水平差異。將化學(xué)合成的miR-491-5p mimics和miR-mimics control利用轉(zhuǎn)染效率較高的脂質(zhì)體Lipofectamine2000，分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MGC803和SGC7901，用QRT-PCR檢測(cè)miRNA的轉(zhuǎn)染效率。在胃癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-491-5p模擬物后使用Western blot方法，檢測(cè)miRNA靶向的JMJD2B在蛋白水平的變化。

6、>　　2、利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)將JMJD2B3'UTR野生型載體pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT或 JMJD2B3'UTR突變型載體pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B MUT與miR-491-5p mimics或miR-negativecontrol mimics共同轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系MGC803，檢測(cè)雙熒光素酶活性，以驗(yàn)證miR-491-5p能否結(jié)合在JMJD2B3' UTR端。
　　3、將miR

7、-49 l-5p mimics和miR-negative control mimics分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MGC803和SGC7901，利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimics后對(duì)胃癌細(xì)胞系克隆形成能力的影響;利用Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimics后對(duì)胃癌細(xì)胞系侵襲能力的影響;利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimics后對(duì)胃癌細(xì)胞系遷移能力的影響。
　　4、利用QRT

8、-PCR檢測(cè)miR-491-5p在胃癌組織以及胃癌患者血清標(biāo)本中的表達(dá)，評(píng)估其是否能作為胃癌的潛在診斷標(biāo)志物。
　　5、利用QRT-PCR檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌菌株感染胃癌細(xì)胞系后miR-491-5p表達(dá)水平變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、四種生物信息學(xué)分析軟件(miRDB、miRanda/microRNA.org、MicrocosmTargets和DIANA-microT v3.0)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-491-5p可以結(jié)合在

9、JMJD2B3' UTR端。QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-491-5p在惡性程度比較高的胃癌細(xì)胞系BGC823、 MGC803、SGC7901和HGC27中的表達(dá)水平相比在GES-1（永生化的胃上皮細(xì)胞系）中的表達(dá)明顯下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);將miR-491-5p mimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MGC803和SGC7901，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中miR-491-5p表達(dá)量明顯增高(P＜0.001);將miR-

10、491-5p mimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MGC803和SGC7901后，Western blot結(jié)果顯示JMJD2B的蛋白水平表達(dá)降低，檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-491-5p在JMJD2B3' UTR端有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此我們構(gòu)建了包含JMJD2B3' UTR的如下載體:JMJD2B3' UTR的野生型載體，三個(gè)位點(diǎn)的總突變載體以及三個(gè)位點(diǎn)的單突變

11、載體。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，與對(duì)照組檢測(cè)相比，pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT與miR-491-5p mimics共同轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系后，胃癌細(xì)胞系的熒光素酶活性明顯下降(P＜0.05);而當(dāng)miR-491-5p mimics與三個(gè)位點(diǎn)的總突變載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性未出現(xiàn)明顯下降;同時(shí)，三個(gè)單突變載體分別與miR-491-5p mimics共同轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系后，熒光素酶活性未出現(xiàn)明顯變化，以上結(jié)果表明miR

12、-491-5p能夠直接結(jié)合于JMJD2B3'UTR端，同時(shí)三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在miR-491-5p對(duì)JMJD2B的調(diào)控中都發(fā)揮作用。
　　3、檢驗(yàn)胃癌細(xì)胞系的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimics后胃癌細(xì)胞系的克隆形成能力顯著受到抑制(P＜0.05);Transwell基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimics能夠降低胃癌細(xì)胞系的侵襲能力(P＜0.05);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-491-5p

13、 mimics后能抑制胃癌細(xì)胞系的遷移能力(P＜0.05)。
　　4、QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示JMJD2B在胃癌組織中的表達(dá)比癌旁正常組織的表達(dá)量升高，而miR-491-5p在胃癌組織中相比正常組織表達(dá)量下降;miR-491-5p在胃癌患者血清中表達(dá)相比正常人群明顯降低，用ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-491-5p診斷胃癌的價(jià)值，AUC為0.919，95％ CI為0.874-0.963，敏感度為94.2％，特異性為76.2％。