水環(huán)境Hg2+的超痕量分子信標熒光檢測技術(shù)及相互作用研究.pdf

1、近年來，隨著工農(nóng)業(yè)以及經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，水環(huán)境中各類重金屬污染越來越嚴重，對生態(tài)環(huán)境和人類自身造成嚴重危害。由于具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，使汞成為目前最受關(guān)注的環(huán)境污染物之一，而具有較高的化學活性和穩(wěn)定性的汞離子（Hg2+）是排入環(huán)境水體中汞的主要存在形式。實現(xiàn)日常對河流、海洋等水體環(huán)境中Hg2+檢測監(jiān)測以及評估至關(guān)重要。因而急需建立一種快速靈敏的方法用于監(jiān)測環(huán)境水中的Hg2+。
　　分子信標（Molecular be

2、acon，MB）目前已成為分子生物學和生物技術(shù)中一種強有力的研究工具。MB的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是影響其性能的重要方面，雜交前后環(huán)狀區(qū)與目標分子的雙鏈結(jié)構(gòu)之間存在熱力學平衡關(guān)系，是它雜交特異性明顯高于常規(guī)線狀探針的關(guān)鍵。本文建立了一種新型的基于微量熱泳動分析（Microscale thermophoresis，MST）的MB探針評估方法，可直接反映反應體系中的相互作用以及熱力學等參數(shù)，克服了傳統(tǒng)預測方法的缺陷和局限性問題。
　　本研究利用M

3、B熒光檢測技術(shù)和Hg2+能夠與胸腺嘧啶（T）反應，形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T復合物的原理，設計與MB環(huán)狀區(qū)存在不同T-T錯配個數(shù)的互補單鏈DNA(Singlestanded DNA，ssDNA)，以水中的Hg2+為靶標物。固定MB與Hg2+的濃度分別為0.2μM和1μM，ssDNA由10μM開始梯度稀釋至16個濃度。通過MST測定三者之間的親和力，優(yōu)化出最優(yōu)的用于捕獲Hg2+的MB-ssDNA體系。
　　分別比較MB與不同錯配個數(shù)

4、的ssDNA兩者之間的親和力和加入Hg2+之后三者之間的親和力，確定了MB-N4是檢測Hg2+的最優(yōu)體系。MB與N4存在時親和力常數(shù)Kd為128±4.1 nM，加入Hg2+之后Kd下降為53.9±2.89 nM。建立了環(huán)境水樣中Hg2+檢測的標準曲線，最低檢出限為3 nM，工作區(qū)間5-320 nM。
　　將MB-Nx體系與非均相的磁珠技術(shù)相結(jié)合，分別采用了流式細胞技術(shù)和懸浮芯片技術(shù)，運用親和素-生物素和氨基-羧基兩種方式將ssDN