應(yīng)激激素對團(tuán)頭魴鐵穩(wěn)態(tài)和嗜水氣單胞菌致病力的影響.pdf

1、應(yīng)激是水生動物細(xì)菌病暴發(fā)的重要誘發(fā)因素。應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的激素水平、代謝和免疫等方面發(fā)生顯著改變。鐵是魚類和微生物中非常重要的微量元素，參與氧氣運(yùn)輸、細(xì)胞增殖、電子傳遞等眾多生命代謝過程；同時也是病原菌感染宿主后爭奪的重要營養(yǎng)因子。目前關(guān)于應(yīng)激抑制魚類免疫機(jī)能的研究已有報道，但是關(guān)于應(yīng)激時病原體侵襲宿主的具體機(jī)制仍不可知。本文從應(yīng)激激素入手，研究了急性應(yīng)激后魚體內(nèi)鐵的變化規(guī)律和相關(guān)調(diào)控基因(鐵調(diào)素和轉(zhuǎn)鐵蛋白)的表達(dá)變化及宿主應(yīng)激激素對病原

2、菌致病力的影響，以期為魚類應(yīng)激的致病機(jī)理和病理學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。
　　團(tuán)頭魴是重要的大宗淡水魚養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖過程中應(yīng)激和嗜水氣單胞菌感染導(dǎo)致的細(xì)菌性出血病非常嚴(yán)重。本研究通過注射皮質(zhì)醇模擬急性應(yīng)激，檢測了團(tuán)頭魴應(yīng)激后不同時間點(diǎn)血漿和肝臟鐵含量，并測定了鐵調(diào)素和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在不同時間點(diǎn)的表達(dá)量，同時利用鐵缺乏serum-SAPI培養(yǎng)基模擬生物體內(nèi)環(huán)境，分析應(yīng)激激素對病原菌的生長、毒力相關(guān)基因的表達(dá)、表型及毒力的變化。結(jié)果如下：

3、r>　　1.定量注射皮質(zhì)醇(10 mg/kg)后，團(tuán)頭魴短時間內(nèi)吸收了腹腔中的皮質(zhì)醇，實(shí)驗(yàn)組0 h時血漿皮質(zhì)醇濃度最高，此后皮質(zhì)醇逐漸消退，但在2、4、8、10 h均維持著較高的皮質(zhì)醇濃度，12 h時與對照組皮質(zhì)醇濃度基本持平，表明定量注射皮質(zhì)醇適宜于建立團(tuán)頭魴急性應(yīng)激模型。團(tuán)頭魴皮質(zhì)醇脅迫后，實(shí)驗(yàn)組血漿鐵含量在0-2 h無顯著變化，4 h后血漿鐵持續(xù)蓄積，8 h時血漿蓄積的鐵有最大值，此后24 h時鐵含量回落到對照組水平；實(shí)驗(yàn)組肝臟鐵

4、含量整體呈現(xiàn)“V”字形變化趨勢，0-2 h肝臟鐵含量保持穩(wěn)定，4 h時肝臟鐵急劇減少，此后肝臟鐵不斷流失，10 h時肝臟鐵含量出現(xiàn)低谷，隨后肝臟鐵含量有所反彈，24 h后鐵含量趨于穩(wěn)定。皮質(zhì)醇脅迫后，肝臟鐵調(diào)素(LEAP1, LEAP2)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)表達(dá)均呈單峰型變化趨勢，分別在8,10,10 h時有最高的表達(dá)水平，在24,48,48 h時恢復(fù)正常表達(dá)量；腸道中Tf表達(dá)量在0 h有略微的上升，8 h時Tf開始大量轉(zhuǎn)錄，并持續(xù)至24

5、 h，最高表達(dá)量出現(xiàn)在10 h，48 h時Tf表達(dá)水平降為正常水平。由此說明，皮質(zhì)醇脅迫造成團(tuán)頭魴鐵穩(wěn)態(tài)失衡，誘導(dǎo)了鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)，激活了機(jī)體的鐵調(diào)控系統(tǒng)。
　　2.嗜水氣單胞菌AH196在serum-SAPI培養(yǎng)基中的生長曲線呈“S”形，較高的去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)濃度(100μM和200μM)能夠在對數(shù)期極大地提高嗜水氣單胞菌AH196的增殖速度，而低濃度的NE(12.5,25和50μM)并

6、不表現(xiàn)出此效應(yīng)，同時嗜水氣單胞菌NJ-35，AH33，AH189和AH301的生長亦可被100μM NE所誘導(dǎo)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，NE顯著上調(diào)了嗜水氣單胞菌熱穩(wěn)定腸毒素(ast)，溶血素(hly)，鐵超氧化物歧化酶(sodB)和鞭毛蛋白B(flaB)基因mRNA表達(dá)水平。NE極顯著增加了外膜蛋白 W(ompW)，外膜蛋白A(ompA)，絲氨酸蛋白酶(ahp)，彈性蛋白酶(ela)，黏附素(aha)，鐵攝取調(diào)節(jié)子(fur)和 ahy