脂多糖協(xié)同多聚左旋精氨酸誘導NCI-H292細胞分泌IL-6、IL-8的JNK信號通路研究.pdf

1、目的：
　　研究脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）協(xié)同多聚左旋精氨酸（Poly-L-arginine, PLA）誘導NCI-H292細胞分泌白介素-6（interleukin-6, IL-6）和IL-8的信號通路機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　用常規(guī)培養(yǎng)基（10％胎牛血清+90%RPMI1640培養(yǎng)液）體外培養(yǎng)NCI-H292細胞，置于37℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱內孵育，根據細胞

2、生長狀態(tài)，一般每3-4天傳代1次。取最佳生長狀態(tài)的細胞，以約3×105/500μl的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。
　　2. Western Blot檢測JNK磷酸化水平
　　按照實驗設計，將NCI-H292細胞分為PLA（5μg/ml）組、LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+LPS（5μg/ml）組，每組刺激時間分別為0、15min、30min、45min、60min、90min、120min，采用Weste

3、rn Blot檢測各組細胞在不同時間點的JNK、p-JNK蛋白含量，以β-actin作內參，并分析比較不同時間點的p-JNK/JNK比值；將 NCI-H292細胞分為空白對照組、PLA（5μg/ml）組、LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+LPS（5μg/ml）組，采用Western Blot檢測比較各組細胞內的JNK、p-JNK蛋白含量，并比較JNK信號通路特異性抑制劑SP600125（30μM）作用前后對JNK磷酸化的

4、影響。
　　3. ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）檢測細胞因子IL-6、IL-8
　　按照實驗設計，將NCI-H292細胞分為空白對照組、PLA（5μg/ml）組、LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+SP600125（30μM）組、LPS（5μg/ml）+SP600125（30μM）組、PLA（5μg/ml）+LP

5、S（5μg/ml）+SP600125（30μM）組和SP600125（30μM）組，根據實驗分組要求先加入JNK信號通路特異性抑制劑SP600125，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內孵育，預先刺激2h后，再加入PLA或/和LPS。共同培養(yǎng)24h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒檢測各組的IL-6和IL-8表達情況，比較各組間存在的差異。
　　4.統(tǒng)計學處理
　　所有實驗均重復3次。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理、分析實驗

6、數據，數據用-x±s表示，單因素方差分析（One-Way ANOVA）用于多組間的比較；LSD（least significant difference）檢驗用于兩兩間比較方差齊時，方差不齊時采用Dunnett,s T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1. PLA作用NCI-H292細胞一定時間（15min、30min、45min、60min、90min、120min）后 JNK磷酸化水平均增加，與空

7、白對照組比較具有統(tǒng)計學差異（P均<0.01），且JNK磷酸化隨時間延長而增加，45min達到高峰（P<0.001）后下降。
　　2. LPS作用時間為15min、30min、45min、60min、90min、120min時，JNK磷酸化水平較空白對照組均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.05），與 PLA類似的是45min之前呈上升趨勢，45min為JNK磷酸化高峰（P<0.01），45min后為下降趨勢。
　　3. PL

8、A+LPS作用NCI-H292細胞15min、30min、45min、60min、90min、120min， JNK磷酸化水平較空白對照組顯著增加，并具有統(tǒng)計學意義（ P均<0.001）， PLA+LPS的作用高峰提前至30min（P<0.01），45min時較前下降（P<0.001），在60min時再次增加后減少（P<0.001），30min的JNK磷酸化水平高于60min，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　4. PLA+

9、LPS組的JNK磷酸化水平顯著高于PLA組或LPS組，PLA+LPS組與PLA組、LPS組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P均<0.001）。
　　5. SP600125能明顯減少PLA或/和LPS刺激NCI-H292細胞的JNK磷酸化水平增加（P均<0.001）。
　　6.與空白對照組比較，PLA組、LPS組和PLA+LPS組的NCI-H292細胞內IL-6和IL-8的表達明顯增加（P均<0.01），并且PLA+LPS組明顯高于

10、PLA組或LPS組（P均<0.001）；SP600125能明顯抑制PLA組、LPS組和PLA+LPS組的NCI-H292細胞表達IL-6、IL-8（P均<0.01）。
　　結論：
　　1. PLA、LPS能激活NCI-H292細胞內的JNK信號通路，并且兩者具有協(xié)同效應。
　　2. LPS能協(xié)同PLA促進NCI-H292細胞分泌IL-6和IL-8。
　　3. JNK信號通路參與LPS協(xié)同PLA誘導NCI-H292