人巨細(xì)胞病毒通過NF-κB信號途徑誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8.pdf

1、目的:
　　 1.觀察人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalo virus，HCMV)感染對人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6和IL-8的表達(dá)變化。
　　 2.探討核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)在HCMV感染致人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌改變中的作用。
　　 方法:
　　 1.在人胚肺成纖維細(xì)胞中擴(kuò)增HCMV病毒，并用空斑定量法測定病毒滴度。
　　 2.原代培養(yǎng)人星

2、形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，計算細(xì)胞純度。
　　 3.HCMV感染人星形膠質(zhì)細(xì)胞，RT-PCR和免疫熒光法檢測HCMV-IE，確定HCMV能否在人原代星形膠質(zhì)中建立感染。
　　 4.RT-PCR和Western blotting檢測HCMV感染導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-6和IL-8表達(dá)變化。
　　

3、 5.免疫熒光法檢測NF-κB的細(xì)胞核移位，Western blotting檢測阻斷NF-κB細(xì)胞核移位后，IL-6和IL-8的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞5d左右，超過80％細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，呈典型的巨細(xì)胞病毒感染后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?？瞻邷y定結(jié)果顯示將病毒液稀釋10-5倍后，平均空斑數(shù)為5.5，計算后空斑形成單位為1.1×107pfu/ml。
　　 2.分離

4、、純化的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光染色后在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞有較強的特異性綠色熒光，GFAP陽性率達(dá)到95％以上。
　　 3.RT-PCR和western blotting結(jié)果顯示感染HCMV的星形膠質(zhì)細(xì)胞均可檢測到HCMV-IE的表達(dá)，而未感染的細(xì)胞則檢測不到。
　　 4.RT-PCR檢測HCMV感染人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞0、6、12、24、48和96h時mRNA比值IL-6/β-actin分別為0.23±0.05、

5、1.31±0.07、1.18±0.05、1.13±0.04、0.74±0.02和0.67±0.04，IL-8/β-actin分別為0、0.65±0.04、0.54±0.06、0.42±0.04、0.19±0.03和0.36±0.05。感染組IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)較未感染細(xì)胞差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。Western blotting檢測感染0、36、48、72、96和120h時蛋白比值IL-6/β-actin分別為0

6、.043±0.01、0.931±0.02、0.852±0.05、0.983±0.03、1.32±0.02和0.95±0.02，IL-8/β-actin分別為0、0.42±0.01、0.61±0.02、1.12±0.03、1.55±0.02和0.81±0.04。感染組IL-6和IL-8蛋白的表達(dá)較未感染細(xì)胞差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 5.免疫熒光結(jié)果顯示:HCMV感染原代星形膠質(zhì)細(xì)胞2、4、7h時，NF-κB發(fā)生了

7、細(xì)胞核移位，其中7h的細(xì)胞核移位最為明顯;而用10μM PDTC(NF-κB活化的抑制劑)孵育的細(xì)胞用HCMV感染時未見明顯的NF-κB細(xì)胞核移位。Western blotting檢測未染毒、PDTC孵育、HCMV感染及HCMV與PDTC共同作用的細(xì)胞蛋白比值IL-6/β-actin分別為0.023±0.01、0.017±0.03、1.642±0.01和0.102±0.01，IL-8/β-actin分別為0、0、1.12±0.01和0。