淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)卵泡發(fā)育與抗氧化作用的影響.pdf

1、哺乳動(dòng)物卵巢卵泡的發(fā)育與閉鎖主要受到細(xì)胞死亡受體和生長(zhǎng)促進(jìn)因子的調(diào)控;生長(zhǎng)促進(jìn)因子既包括激素（如促性腺激素），也包括卵巢內(nèi)調(diào)節(jié)因子（如性腺類固醇激素、細(xì)胞因子及胞內(nèi)蛋白等）。動(dòng)物卵巢含有大量的原始卵泡，往往僅有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育到排卵前的階段或排卵;絕大多數(shù)卵泡會(huì)通過某種機(jī)制發(fā)生閉鎖退化。死亡受體的激活或者缺少關(guān)鍵生長(zhǎng)促進(jìn)因子，可能是導(dǎo)致凋亡的主要原因。一般認(rèn)為，氧化應(yīng)激、輻射、毒素和藥物等均可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡在卵泡閉鎖中扮

2、演著重要的角色。
　　淫羊藿(Epimedium)是小檗科淫羊藿屬多種植物干燥莖葉的統(tǒng)稱，傳統(tǒng)上具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功能。淫羊藿苷(ICA)和淫羊藿多糖(EPS)是淫羊藿(EP)的主要有效成份。淫羊藿能夠直接刺激大鼠卵泡顆粒細(xì)胞分泌雌二醇;淫羊藿苷可促進(jìn)小鼠卵泡發(fā)育，使其發(fā)情周期提前，并能提高大鼠血清中SOD抗氧化酶的活性;淫羊藿多糖能夠提高小鼠的卵巢子宮系數(shù)，并具有抗氧化作用;但迄今少有淫羊藿苷或淫羊藿多糖對(duì)小鼠卵泡卵母

3、細(xì)胞體外發(fā)育和卵泡細(xì)胞抗氧化作用的報(bào)道。本試驗(yàn)通過研究淫羊藿有效成分對(duì)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，進(jìn)而分析淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)卵泡細(xì)胞凋亡的影響及其抗氧化作用，以期評(píng)價(jià)淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用，為淫羊藿有效成分的應(yīng)用及卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)提供有益的參考。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育與成熟的影響
　　分別用不同劑量淫羊藿苷（ICA，0.1、0.3、0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖(

4、EPS，2、4、6和8 mg)每天1次連續(xù)灌服小鼠7和14d，設(shè)置生理鹽水灌服對(duì)照組。小鼠致死后按組采集卵巢有腔卵泡，分離卵母細(xì)胞置于M16培養(yǎng)液中作常規(guī)體外培養(yǎng)24h，檢查小鼠卵母細(xì)胞第一極體(pbI)排出情況，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞體外成熟率。再將各組成熟卵母細(xì)胞分別進(jìn)行體外受精，KSOM液中培養(yǎng)6h觀察受精情況。結(jié)果顯示，連續(xù)灌服7d淫羊藿苷0.5 mg組的pbI排出率均較對(duì)照組有顯著提高（75.0％對(duì)63.3％;P＜0.05），并高于連續(xù)

5、灌服14 d所獲pbI排出率最高的淫羊藿苷0.3 mg組(68.1％;P＜0.05);淫羊藿多糖僅連續(xù)灌服7d的8 mg組pbI排出率較對(duì)照組顯著升高(80％;P＜0.05)。連續(xù)灌服7d淫羊藿苷0.3 mg組的受精率較對(duì)照組明顯提高（69.4％對(duì)41.1％;P＜0.05）;在連續(xù)灌服14 d組別中，與對(duì)照組相比淫羊藿苷和淫羊藿多糖組的受精率增加均不顯著(P＞0.05)。
　　2.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)小鼠發(fā)育的影響
　　連

6、續(xù)7d分別用不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg）灌服小鼠，生理鹽水對(duì)照。每天記錄小鼠情況，結(jié)束給藥次日致死小鼠，稱量并計(jì)算各組小鼠體重、增重和內(nèi)臟指數(shù)（心、肝、脾、肺和腎）。結(jié)果顯示，連續(xù)灌服7d淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)雌性小鼠體重、增重及內(nèi)臟指數(shù)（心、肝、脾、肺和腎）均無顯著影響(P＞0.05);但淫羊藿苷和淫羊藿多糖處理組均不同程度提前了母鼠的發(fā)情期。
　　3.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)小鼠卵泡細(xì)胞凋

7、亡的作用
　　健康小鼠連續(xù)7d灌服不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg），生理鹽水對(duì)照。分離收集各組小鼠卵泡細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組卵泡細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）組和淫羊藿多糖(6 mg)組卵泡細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05);淫羊藿苷和口淫羊藿多糖處理組卵泡細(xì)胞早期凋亡率均有顯著下降(P＜0.05)。采集各組卵泡細(xì)胞、卵巢和子宮組織，用RT-PCR檢測(cè)凋亡基因Bax和抗

8、凋亡基因Bcl-2表達(dá)，結(jié)果表明淫羊藿苷0.7 mg組卵泡細(xì)胞Bcl-2/Bax基因相對(duì)表達(dá)量比值顯著提高(P＜0.05);但淫羊藿多糖6 mg組卵泡細(xì)胞Bcl-2/Bax基因相對(duì)表達(dá)量比值并無明顯改變（P＞0.05），8 mg組反而顯著降低(P＜0.05);淫羊藿苷和淫羊藿多糖處理對(duì)卵巢和子宮Bcl-2/Bax基因相對(duì)表達(dá)量比值的影響均不顯著（P＞0.05）。
　　4.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)小鼠卵泡細(xì)胞ROS和O2-的影響

9、>　　連續(xù)7d灌服不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg），生理鹽水對(duì)照，分離采集各組小鼠卵泡細(xì)胞，用DCFH-DA法流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧(ROS)水平，用抗超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)試盒檢測(cè)超氧陰離子水平（O2-）。結(jié)果顯示，淫羊藿多糖8 mg處理組卵泡細(xì)胞ROS和O2-水平顯著提高(P＜0.05)，淫羊藿多糖6 mg處理組卵泡細(xì)胞ROS水平顯著提高(P＜0.05);淫羊藿苷0.5和0.7 m

10、g處理組卵泡細(xì)胞的ROS和O2-水平無顯著變化(P＞0.05)。
　　5.淫羊藿苷和淫羊藿多糖對(duì)小鼠卵泡細(xì)胞抗氧化作用的影響
　　用不同劑量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）、淫羊藿多糖（6和8mg）和生理鹽水（對(duì)照組）連續(xù)灌服小鼠7d，采集各組小鼠卵泡細(xì)胞，分別用超氧化物歧化酶試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒和過氧化氫酶試劑盒檢測(cè)卵泡細(xì)胞SOD、GPX和CAT活性。結(jié)果顯示，淫羊藿苷和淫羊藿多糖處理均可不同程度地提高卵泡細(xì)胞

11、GPX和CAT抗氧化酶活性，尤其是淫羊藿多糖8 mg組較對(duì)照組差異顯著(P＜0.05);而各試驗(yàn)組SOD抗氧化酶活性則與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。各組卵泡細(xì)胞、卵巢和子宮組織用RT-PCR檢測(cè)抗氧化酶基因SOD1、SOD2和GPx1基因相對(duì)表達(dá)量，表明淫羊藿苷0.7 mg組的卵泡細(xì)胞SOD1、SOD2均有顯著提高，且子宮GSH-PX1基因相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)。淫羊藿多糖8 mg組的SOD2和GSH-PX1基因表達(dá)量