溫陽補腎方治療激素性股骨頭壞死的臨床觀察和影響破骨細胞信號通路的實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過臨床觀察溫陽補腎方治療激素性股骨頭壞死的療效，并觀察溫陽補腎方含藥血清對破骨細胞TRACP活性、Cathepsin-K、MMP-9、RANK基因及培養(yǎng)上清液RANK、RANKL的影響，探討溫陽補腎方對防治激素性股骨頭壞死的機理。
　　方法：
　　1、本課題臨床研究遵循隨機對照原則，對37例激素性股骨頭壞死患者進行臨床觀察，其中治療組18例，對照組19例。治療組給予溫陽補腎方;對照組給予仙靈骨葆膠囊。服藥

2、同時輔助功能鍛煉，并避免負重和長距離行走。分別于治療前、治療后對患者進行VAS、Harris評分并統(tǒng)計分析。
　　2、溫陽補腎方含藥血清制備:將60只Wistar大鼠隨機分為4組（對照組、溫陽補腎方低劑量組、中劑量組、高劑量組），每組15只。溫陽補腎方低劑量組(4.35g/kg·d)、中劑量組(8.70g/kg·d)、高劑量組（17.40g/kg·d）、對照組用等量生理鹽水灌胃。每日早晚各一次，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃1h后，制備溫

3、陽補腎方含藥血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　3、40ng/mL RANKL和20ng/mL M-CSF誘導(dǎo)因子聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細胞，2d換液一次。每天用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長情況，TRAP染色鑒定破骨細胞。
　　4、各組加入溫陽補腎方含藥血清干預(yù)后，酶動力法測定各組破骨細胞上清液TRACP值。
　　5、實時熒光定量PCR檢測溫陽補腎方對破骨細胞Cathepsin-K、MMP-9、RANKmRN

4、A表達的影響。
　　6、酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組上清液RANK、RANKL含量
　　7、免疫組化法檢測破骨細胞中RANK的表達。
　　結(jié)果：
　　1、臨床觀察結(jié)果示:溫陽補腎方組和對照組均能增加Harris評分中功能評分，溫陽補腎方組優(yōu)于對照組(P＜0.05)，VAS評分、Harris其他各項評分的增加值及療效方面組間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2、40 ng/mL RANKL和20 ng/mL

5、 M-CSF誘導(dǎo)因子聯(lián)合誘導(dǎo)RAW264.7細胞后，經(jīng) TRAP染色鑒定后，可獲得成熟破骨細胞。
　　3、與空白對照組相比，溫陽補腎方低、中、高劑量組在干預(yù)24h、48h時能使細胞上清液TRACP活性降低(P＜0.05）;中劑量組低于低劑量組、高劑量組(P＜0.05）;低劑量組與高劑量組(P＞0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TRACP活性隨溫陽補腎方低、中、高劑量組含藥血清干預(yù)時間逐漸降低。
　　4、實時熒光定量PCR檢測結(jié)果提

6、示溫陽補腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組可降低破骨細胞Cathepsin-K基因、MMP-9基因表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;溫陽補腎方中劑量組＜高劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　5、ELISA法檢測結(jié)果提示溫陽補腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組培養(yǎng)上清液中RANK含量與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);溫陽補腎方高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;溫

7、陽補腎方中劑量組與高劑量組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。溫陽補腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組上清液中RANKL含量與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;溫陽補腎方中劑量組＜高劑量組＜低劑量組，三組組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　6、免疫組化法提示溫陽補腎方可減少RANK表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;溫陽補腎方高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　

8、　7、實時熒光定量PCR檢測結(jié)果溫陽補腎方低劑量組、中劑量組和高劑量組可降低RANK基因表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);溫陽補腎方中劑量組＜高劑量組＜低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);溫陽補腎方中劑量組與高劑量組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、溫陽補腎方能有效改善激素性股骨頭壞死患者的生活質(zhì)量，減輕疼痛，療效確切。
　　2、溫陽補腎方能明顯抑制破骨細胞活性。對破骨細胞性骨吸